临床免疫分型时，抗体混合物的配制和使用，请做好质控

niwanmao

流式细胞术是一种复杂的技术，用着复杂的仪器，使用着多种检测方案和非常特异的试剂。 这些试剂中最重要的是针对特定细胞抗原的荧光染料标记抗体。 必须格外小心地仔细选择最佳的可用抗体、荧光素及其组合，然后优化每种方案以增加准确性并减少误差和差异。

抗体混合物是临床流程实验室中非常有用的工具，有助于检测的一致性。 抗体混合物是将分析用的单个抗体组合到一管中。 使用抗体混合物可以减少技术人员在实验预处理上花费的时间，最大程度地减少手动移液错误、标准化结果并跟踪试剂的使用。

自己制备抗体混合物时，必须格外小心，因为在混合物制备中所犯的任何错误都可能非常昂贵，并可能导致误诊。 自制抗体混合物会产生很大概率的吸取体积错误、单个抗体选择错误、遗漏抗体或多次吸取同种抗体等风险。 无论我们有多认真，我们都是人，错误不可避免会发生。

重要的是要注意，当荧光素标记的抗体被混合在一起时，荧光染料之间的相互作用会导致各个试剂的稳定性发生变化，可能会引起表达变化。 与单个试剂相比，混合物性能和稳定性的初步验证和质量控制是在临床流程实验室中使用试剂混合物的先决条件。 试剂混合物中荧光抗体不稳定性的文献记载有很多，并且已经阐明了许多原因。 但是，不管原因如何，在使用过程中，会发现诸如荧光染料亮度下降、串联染料断裂或某些情况下荧光素亮度明显增加等结果。

在美国，只允许制造商开发、优化和制造FDA批准的流式检测方案的抗体混合物。 在这些情况下，制造商可以提供诊断要求、使用说明和测定的操作步骤。 使用FDA批准的测定法的实验室必须遵循制造商的规程，不得进行任何程序更改。

但是，大多数流式细胞术检测方法尚未获得FDA批准，属于实验室开发的检测（LDT）类别。 LDT主要使用归类为分析物特异性试剂（ASR）的荧光素 抗体。 FDA已经对使用此类ASR抗体用于LDT的实验室进行了全权监督。 实验室可以将这些单个ASR抗体配制成抗体混合物，但实验室有责任针对这些混合物进行优化和验证，以供自己使用，并且不能出售或提供给其他实验室。

流式细胞术测试（包括抗体混合物）的标准化工作仍在继续。 每个实验室必须有自己的书面规程来开发、优化和验证抗体混合物。 要求清楚记录此过程。 2013年，经过协调一致的努力，《Validation of cell‐based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS》出版了。 最近，这份指南文件将更加详细和全面：CLSI Guideline H62--the Validation of Assays Performed by Flow Cytometry。大家都在争取促进并最终使该过程标准化。我们也开始看到越来越多的制造商研制的复杂流式细胞检测方案抗体混合物获得FDA（IVD）许可。

抗体混合物优缺点
优点

使用抗体结合物混合物的主要好处是提高实验室效率，减少或消除移液错误以及标准化/减少变异性。

效率：分配单个体积的抗体混合物比将单个试剂移入单个试管要快得多。
减少错误：将大量测试所需的试剂合并到一个混合管中，可减少技术人员手动吸移试剂的次数，从而减少发生移液错误的机会。
标准化：自配混合抗体减少了单个抗体移液的误差。
缺点

如果抗体混合物过期，可能会浪费试剂。 注意：当使用的任何一种抗体都失效时，整个混合物就会失效。 必须仔细记录和监控所有各个有效期限。
如果配制抗体混合物时出错，则有可能出错甚至易致误诊，并且会使得已配好的混合物严重浪费。 随着时间的推移，抗体混合物也可能发生串联染料分解。
抗体混合物的验证
验证抗体混合物，有两种方法： 一是将抗体混合物与其组成的单个抗体染色做对比。这里有个前提，就是需要保证配制混合物的抗体和对比的单个抗体必须是完全一致的。 二是将抗体混合物标记已知的样本，用已知细胞群的表达来验证混合物中各个抗体是否正常。大多数情况下可以用正常全血，但对于某些正常样本不表达或者含量非常低的特殊标记（如CD34等），就需要找特殊患者的样本或专门的质控品。

抗体混合物的稳定性
抗体混合物的稳定性与实验室配制方法和设置以及混合物使用的抗体荧光素等有关，也与分装大小和使用频率相关。每次将分装的小瓶从冰箱中取出使用时，都会受到温度波动、环境光和蒸发的影响，因此通常较小的分装体积更容易保持较长时间的稳定。建议使用琥珀色的小瓶来保护荧光染料免于光漂白和分解。

抗体混合物中，最不稳定的抗体荧光素的开瓶稳定性将决定混合物的最长保存期限。请注意，实验室自配的抗体混合物的稳定性通常明显短于单个抗体的稳定性，如果混合物中任何单个抗体已过期，则应将该抗体的到期时间作为该混合物的稳定性极限时间。

确定实验室自制抗体混合物的稳定性时，必须格外小心。 串联染料标记的抗体易分解产生假阳性信号。 例如，CD10 APC-Alexa750和CD34 APC的抗体混合物，有可能会因为CD10 APC-Alexa750的分解，在APC通道中错误地显示CD34阳性，从而导致误诊。

抗体混合物的文档记录
法规和最佳做法要求保留详细记录，以追踪试剂、抗体混合物的制备和质量控制，无论它们是在实验室中生产还是由厂商生产。

对于实验室自制的抗体混合物，必须记录每个抗体批号、接收日期、使用日期和制造商到期日期。 实验室应无限期保留最初的抗体混合物优化、验证和稳定性研究报告，并获得医学主管的批准。 每种配制抗体混合物的专用文件必须包括所用每种荧光素标记抗体的清单、批号和有效期、制备日期、有效期（由稳定性研究确定）和质量控制数据。

新的抗体混合物混合物的质量控制需要进行批次间比较，以确定新的混合物是否可接受。 如果单个抗体批次未变动，则混合物批次之间的差异应最小。 新批次抗体不应表现出超出可接受范围的变异，例如，新批次抗体与当前批次的MFI差异不应该大于0.5 log。批次间的变化还应随时间进行监控，以确保能够及时发现试剂性能的上升或下降趋势，Levey-Jennings图是一个有用的工具，可以直观地跟踪随时间变化的多个批次之间的变化。 如果没有Levey-Jennings的监视，很可能不会检测到随时间的变化，或会导致性能发生较大变化，从而可能影响区分肿瘤群体和正常群体的性能。

如果制备了大量抗体混合物并将其分装到单独的容器中使用，则仅需执行一次验证，只要在确定的稳定性期限内用完即可。当然，这是假设日常过程和仪器质量控制都在既定范围内的前提条件下。

参考文献：https://www.cytometry.org/web/modules/Module_16.pdf

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主要还是串联染料容易出事