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[标本处理] 【求助,3颗流星】强荧光染料调节2色补偿的问题

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发表于 2020-5-5 12:33:55 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏3流星已解决
本帖最后由 cocoa 于 2020-5-6 11:13 编辑

问题一:
我的细胞中药物是PE荧光,FITC是染料荧光,这种情况下,荧光是极强的(相对于抗体染料)。
单染管如FITC单染管,图1,2,没办法区分阳性群和阴性群,该怎么用flowjo调补偿?
我试了下用什么都不染的阴性管圈阴性群(图3),但是没有明显补偿效果不知道为什么?
问题二:
只有 阳性细胞群中位数阴性细胞群中位数 才是正确的补偿,flowjo在调补偿时没有显示中位数,是需要自己在面板上加上这个数值然后判断是否调整到位吗?如图4

图1

图1

图2

图2

图3

图3

图4

图4

最佳答案

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1、如果阴性和阳性分不开,不建议用来调节补偿。PE你这里可以用未加药的细胞+加药的细胞调节PE漏到FITC的荧光,而要调节FITC漏到PE 的补偿,需要你用该种细胞阳性标记的FITC抗体来调节。 2、FlowJo调补偿,是有点繁琐,看中位数,我印象中窗口下方的Statisticstatistics下面可以添加的。
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发表于 2020-5-5 12:33:56 | 显示全部楼层
1、如果阴性和阳性分不开,不建议用来调节补偿。PE你这里可以用未加药的细胞+加药的细胞调节PE漏到FITC的荧光,而要调节FITC漏到PE 的补偿,需要你用该种细胞阳性标记的FITC抗体来调节。
2、FlowJo调补偿,是有点繁琐,看中位数,我印象中窗口下方的Statisticstatistics下面可以添加的。
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 楼主| 发表于 2020-5-5 22:21:20 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-5-5 20:50
1、如果阴性和阳性分不开,不建议用来调节补偿。PE你这里可以用未加药的细胞+加药的细胞调节PE漏到FITC的荧 ...

谢谢老师的回复,有一点不太理解的地方,就是我的FITC其实就是CFSE染料的荧光,并不是抗体,如果找FITC抗体的话,是只要是FITC标记的抗体都可以吗?还有就是刚才我按照您说的调节了一下,如图,不知道这样的补偿值可以用吗?
补偿.png
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发表于 2020-5-6 08:15:17 | 显示全部楼层
cocoa 发表于 2020-5-5 22:21
谢谢老师的回复,有一点不太理解的地方,就是我的FITC其实就是CFSE染料的荧光,并不是抗体,如果找FITC抗 ...

CFSE就更简单了,用CFSE标记细胞是肯定阳性的,你就拿你们标记好CFSE的细胞和未标记的细胞混合,不就有明显的阳性群和阴性群了?
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 楼主| 发表于 2020-5-6 08:25:58 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-5-6 08:15
CFSE就更简单了,用CFSE标记细胞是肯定阳性的,你就拿你们标记好CFSE的细胞和未标记的细胞混合,不就有明 ...

我可不可以理解为,把阴性管的细胞和单染CFSE管的细胞混合就可以啦?那为啥不能直接用阴性管作为阴性群调补偿吖?
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 楼主| 发表于 2020-5-6 08:37:24 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-5-6 08:15
CFSE就更简单了,用CFSE标记细胞是肯定阳性的,你就拿你们标记好CFSE的细胞和未标记的细胞混合,不就有明 ...

还有就是,我最后评论的那个图FITC的阴性群荧光强度到了-600了,才达到了横平竖直的效果,不知道这样的负值太大的补偿可以用吗~~
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发表于 2020-5-6 08:39:50 | 显示全部楼层
cocoa 发表于 2020-5-6 08:25
我可不可以理解为,把阴性管的细胞和单染CFSE管的细胞混合就可以啦?那为啥不能直接用阴性管作为阴性群调 ...

只有混在一起,形成阳性群和阴性群都有,并且分开的情况,才是调节补偿的正确之道。
两管分开,获取的条件还是有差异的,而且无法使用自动补偿功能。

先按照上面所说的做完再说,你目前的这些数字都是不能反映真实情况的。
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 楼主| 发表于 2020-5-6 09:17:32 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-5-6 08:39
只有混在一起,形成阳性群和阴性群都有,并且分开的情况,才是调节补偿的正确之道。
两管分开,获取的条 ...

好的,谢谢倪老师的耐心回复
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