为什么加了荧光抗体之后荧光强度还降低？

素医

请问如图所示，最左边是空白对照，右边是实验组，为什么有的标记再加了抗体之后荧光强度反而比对照组还低，有的又不低？空白对照组是没破膜的，另外两组实验组都破核膜。

素医

@niwanmao 倪老师，您好，我之前问过一些老师，他们说也没遇见过这种情况，想请您帮助一下~谢谢~

素医

并且我发现荧光强度减低是随抗体浓度变化的，浓度越高，减的越低。实验组是单染管，前面是高浓度抗体，后面是低浓度抗体。

niwanmao

我不清楚你这里测的是什么抗体，用的浓度是多少？
抗体滴定你需要先了解一下，抗体滴定曲线多数情况下是一条曲线，只有中间1个浓度是最佳，两边一般都要差的，所以抗体用量并非越多越多。

素医

niwanmao 发表于 2020-5-7 14:19
我不清楚你这里测的是什么抗体，用的浓度是多少？
抗体滴定你需要先了解一下，抗体滴定曲线多数情况下是一 ...

老师您好，我用的抗小鼠T-bet，eBioscience。浓度是按照说明书0.5 µg/test然后倍比稀释。想做单染管看看有没有明显分群，但是发现加过抗体后荧光强度部分细胞竟然比空白对照还要低很多是什么原因？

niwanmao

素医 发表于 2020-5-7 14:45
老师您好，我用的抗小鼠T-bet，eBioscience。浓度是按照说明书0.5 µg/test然后倍比稀释。想做单染管看看 ...

你这里所谓的空白对照是否经过同样的固定、破膜？

素医

niwanmao 发表于 2020-5-7 17:48
你这里所谓的空白对照是否经过同样的固定、破膜？

谢谢您的回复。这里的没有破膜，我之前发现了这个问题，然后核对了之前破过膜的空白对照，跟我发上来的空白对照图相比除了FCS中主群左移了，其再PE-CY7的基础荧光强度和没破膜是一样的。所以我怎么都想不通为什么加了抗体后部分细胞荧光强度会比空白对照还低，这个结果我回顾了一下之前做的，发现重复了几次都一样，所以不是偶然事件。跟我之前做的实验对比：空白组对比实验组唯一的区别就是一个加了抗体，一个没加抗体。不知道您遇见这种情况没有，有什么原因可能会导致这种情况？

素医

niwanmao 发表于 2020-5-7 17:48
你这里所谓的空白对照是否经过同样的固定、破膜？

是否是因为不是同型对照的缘故？这两天准备做同型对照作为阴性对照看看

素医

niwanmao 发表于 2020-5-7 17:48
你这里所谓的空白对照是否经过同样的固定、破膜？

破膜均是用的赛默飞FOXP3套装

niwanmao

素医 发表于 2020-5-7 21:06
谢谢您的回复。这里的没有破膜，我之前发现了这个问题，然后核对了之前破过膜的空白对照，跟我发上来的空 ...

1、空白对照只用于大致的了解电压水平是否合适，拿来做设门，是不合理的。
2、为什么出现这种情况，目前单纯从你这些文字里面，无法给出定论，但是我相信问题肯定出现在处理上，处理上面肯定有差异，最终导致这种现象出现。