小鼠Th1/Th2/Th17细胞检测问题

zhanggaochao032

老师们好，我做小鼠脾脏Th细胞检测,配色方案如下CD3-PE-cy7，CD8-APC-cy7，IFN-γ-FITC，IL-4-APC，IL-17-PE，
用的CD3+CD8-反选CD4
刺激剂和阻断剂用的是 ebioscience的500×cocktail，货号是00-4970-03和00-4980-03
破膜剂用的也是eBioscience™ Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set；货号是 00-5523
分别用溶血素和小鼠脾脏单细胞悬液做了预实验，刺激剂浓度梯度为500ul培养基 加 1ul，2ul，3ul，刺激时间做了4h，6h，12h
均检测不到Th2细胞，麻烦老师帮忙看看，优化一下实验条件，谢谢；
附件为完整的报告

zhanggaochao032

人工置顶。。。。

niwanmao

首先，蓝色这群可忽略，因为CD3-，考虑是细胞碎片。
其次 ，IL-4确实没看到明显阳性群，考虑以下几种可能性：（1）你做的小鼠脾脏内Th2细胞本身就少；（2）对Th1的刺激强于Th2？ （3）从IL-4峰右移明显，是否需排除处理因素？

zhanggaochao032

niwanmao 发表于 2020-8-29 08:45
首先，蓝色这群可忽略，因为CD3-，考虑是细胞碎片。
其次 ，IL-4确实没看到明显阳性群，考虑以下几种可能性 ...

谢谢老师的回复，我是同一批处理的细胞，做了2次，后面均有移位；在做预实验，测出的Th2比例比报道明显偏低；Th2减去同型 基本都是负值了；
麻烦问倪老师，和刺激剂有关系吗？

niwanmao

zhanggaochao032 发表于 2020-8-29 08:51
谢谢老师的回复，我是同一批处理的细胞，做了2次，后面均有移位；在做预实验，测出的Th2比例比报道明显偏 ...

一般说来，PMA和离子霉素是通用型的刺激剂。如果都这样的话，是否需考虑更换为一个新克隆号的IL-4抗体？尽量用IgG2类型的，克隆号可参考文献的。

ucbio

上传一张今天做的Th1/Th17，倪老师给瞧瞧，基本是BD的试剂，不知道为何比例这么低？当然刺激时间晚上6点——早上9点......