拟检测T细胞亚群的PD1及IFNG表达，麻烦指点一下

snelgar2020

准备检测疾病状态下人外周血不同T细胞亚群的PD1及IFNG表达。
机器是BD canto2 至尊版 3激光10色（4-3-3）。
抗体荧光选择：CD3 percp-cy5.5, CD4 AF488, CD8 APC-H7;
                       CD45RA BV605, CCR7 BV 421,  CD69 PE-Cy7;
                       PD-1 AF647, IFNG PE。
问题：1.荧光抗体选择是否需要调整？
          2.是否需要购买同型对照？
          3.如何设置FMO？
          4.实验过程中还有什么需要注意的吗？
感谢倪老师提供这么好一个平台，希望大家多多指点。

niwanmao

1、荧光素初步看问题不大，但关键是PD-1的克隆号蛮关键。目前文献里面用的最多的是AbCAM的这个PD-1（https://www.abcam.com/pd1-antibody-nat105-ab52587.html），但是是无荧光的，得间标。按照你这个荧光素搭配的话，也可选择APC的PD-1，相对来说似乎BL的这个较多见：https://www.biolegend.com/en-us/ ... -pd-1-antibody-4413，EB的也有不少：https://www.thermofisher.com/ant ... ID=AFLCA-17-9969-42。可根据自己的需求选择。
2、同型对照原则上不要，但是为了避免到时候某些不从事流式的reviewer会要求，还是买吧，这是没办法之举。
3、FMO必须，因为你要测PD-1和IFN-g，所以设置两管FMO。
4、其它要注意的可自己根据实际情况再来问。实验都没开始，每个人的注意事项都不同：）

snelgar2020

niwanmao 发表于 2020-9-10 07:40
1、荧光素初步看问题不大，但关键是PD-1的克隆号蛮关键。目前文献里面用的最多的是AbCAM的这个PD-1（https: ...

谢谢倪老师。我们课题组的抗体之前都是BD的，现在混搭biolegend的PD-1没有关系吧？，因为这个货期最短。现在买bd的抗体等很久，打算部分抗体换成biolegend，这样不同牌子混搭应该没有问题吧？

snelgar2020

snelgar2020 发表于 2020-9-10 11:03
谢谢倪老师。我们课题组的抗体之前都是BD的，现在混搭biolegend的PD-1没有关系吧？，因为这个货期 ...

pd-1之前师兄用BD的检测没有问题，不是biolegend这个克隆号。但是TIM-3、CTLA4、LAG-3测出来的表达量就很低，尤其是后两者多数感染状态下的病人基本没有表达或很低表达，和文献报道的其他感染性疾病差异很大，难道是因为克隆号的原因？

niwanmao

snelgar2020 发表于 2020-9-10 11:10
pd-1之前师兄用BD的检测没有问题，不是biolegend这个克隆号。但是TIM-3、CTLA4、LAG-3测出来的表达量就很 ...

抗体混搭没事。
检测结果，和克隆号相关很大，尽量参考权威、影响因子高的文献选择克隆。

snelgar2020

niwanmao 发表于 2020-9-10 21:41
抗体混搭没事。
检测结果，和克隆号相关很大，尽量参考权威、影响因子高的文献选择克隆。 ...

谢谢老师

PetraF

老师，请教一下为什么一定要用FMO对照呢，同型对照为什么原则上不要呢，谢谢！

niwanmao

PetraF 发表于 2023-10-15 10:26
老师，请教一下为什么一定要用FMO对照呢，同型对照为什么原则上不要呢，谢谢！ ...

主要看实验设计，如果荧光渗漏是背景信号的主要来源，那么FMO是首先要设置的。

如果你只做单色，那么可以用同型对照。