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教你如何用流式快速检测突触内Tau蛋白,研究阿尔茨海默病

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发表于 2020-9-22 16:34:09 | 显示全部楼层 |阅读模式

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突触是大脑的功能单位,突触丢失被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)认知障碍的早期相关因素。然而,突触结在光镜水平上的可视化程度较差,EM对感兴趣的蛋白的免疫检测主要是定性的,并且面临着表位被遮蔽和固定化假象等技术问题。因此许多研究者采用生化突触体制备的方法来研究突触蛋白和功能。
突触体是将新鲜的脑组织在等渗蔗糖中轻轻匀浆,形成球形颗粒,其中含有线粒体和神经递质释放的细胞器(图1a)。突触体主要是突触前结构,也有一些粘附的突触后结构,自20世纪60年代以来,这种制备被广泛用于药理学研究体外受体结合和神经递质释放。经典的纯化方案包括Ficoll不连续梯度纯化突触体粗颗粒,也称为P2。即使有额外的密度梯度纯化,突触体制剂也是不纯的,并含有游离的囊泡、线粒体、髓鞘和膜碎片;用电压敏感染料标记,通过流式细胞仪定量,可发现,纯化的突触体部分含有约83%的突触体(Flow cytometric analysis of rat striatal nerve terminals. Wolf ME, Kapatos G J Neurosci. 1989 Jan; 9(1):94-105.)。梯度纯化需要额外的时间,降低了活力,因此采用P2部分来研究功能,基本上不受太大影响。
流式细胞仪能快速、同时分析单细胞的多种特性,包括细胞大小、复杂程度以及各种染料和荧光素结合的抗体所发出的荧光。流式细胞仪能精确量化荧光的两个参数;阳性率(%)和荧光亮度(相对荧光强度,RFU)。由于突触体类似于细胞,所以突触体的流式分析是研究突触体一种强有力的方法,最早的研究使用的是Percoll梯度纯化的突触体。然而,考虑到对P2的分析能在制备时间和突触产量上优势更显著,Gylys KH等人从2000年开始开发了P2部分的流式细胞术分析程序,并通过各种方法证明,基于颗粒大小的分析(只包括0.5和1.5μm之间的颗粒)可以囊括约95%纯度的突触体,优于用梯度纯化获得的约80%纯度。
流式细胞仪和突触体制备的组合技术为常规生化或病理技术无法提出的问题提供了定量的答案,在此提供一个详细的分析人类AD样本免疫标记突触体的方案。
nihms926400f1.jpg

P2部分提取步骤所需试剂
1、脑组织冷冻保存和突触体(P2)富集部分的制备方案。 用去离子水制备所有的溶液。为了长期储存,所有原液都需要通过0.45μm的过滤器进行过滤消毒。
  • 0.2 M ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) stock solution: weigh 0.744 g of EDTA disodium salt (FW 372.2), add 8 ml of water, adjust the pH to 8.0 with constant stirring (see Note 1); when EDTA salt is completely dissolved adjust volume to 10 ml with water. Store the solution at room temperature (stable for more than 1 year).
  • 0.2 M ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) stock solution: weigh 0.761 g of EGTA (FW 380.4), add 8 ml of water, adjust the pH to 8.0 with constant stirring (see Note 1); when EGTA is completely dissolved adjust volume to 10 ml with water. Store the solution at room temperature (stable for more than 1 year).
  • 0.1 M phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) stock solution: dissolve 0.174 g of PMSF (FW 174.2) in 10 ml of 100 % ethanol (protect from light). Divide into 200 μl aliquots and store at −20 °C (stable for more than 1 year).
  • 0.1 M sodium pyrophosphate decahydrate (NaPP) stock solution: weigh 4.46 g of Na4P2O7·10H2O (FW 400.1) and dissolve in 100 ml of water. Store at 4 °C (stable for 3–4 weeks).
  • 1 M sodium fluoride (NaF) stock solution: dissolve 0.42 g of NaF (FW 41.99) in 10 ml of water. Store at 4 °C (stable for more than 1 year).
  • 1.5 mM pepstatin A stock solution: dissolve 5 mg of pepstatin A (FW 685.9) in 5 ml of 100 % Methanol. Divide into 100 μl aliquots and store at −20 °C, avoid freeze–thaw cycles (stable for more than 1 year).
  • 20 mM leupeptin stock solution: dissolve 10 mg of leupeptin (FW 475.6) in 1 ml of water. Divide into 100 μl aliquots and store them at −20 °C, avoid freeze–thaw cycles (stable for more than 1 year).
  • 1.5 mM aprotinin stock solution: dissolve 10 mg of aprotinin in 1 ml of water. Divide into 100 μl aliquots and store them at −20 °C, avoid freeze–thaw cycles (stable for more than 1 year).
  • Trypsin inhibitor (from soybean): dissolve 100 mg of trypsin inhibitor in 10 ml of water. Divide into 200 μl aliquots and store them at −20 °C, avoid freeze–thaw cycles (stable for more than 1 year).
  • 1 M Tris–HCl, pH 8.0: dissolve 12.1 g of Tris base in 90 ml of water. Adjust pH to 8.0. Bring up the volume to 100 ml with water. Divide into 1 ml aliquots and store at −20 °C (stable for more than 1 year).
  • Cryopreservation buffer (0.32 M sucrose, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0.2 mM PMSF, 1 mM NaPP, 5 mM NaF, 10 mM Tris–HCl, pH 8.0): to make 100 ml of cryopreservation buffer, weigh 11 g sucrose and dilute it in 90 ml of deionized water (see Note 2), add 100 μl of 0.2 M EDTA, 100 μl of 0.2 M EGTA, 200 μl of 100 mM PMSF, 1 ml of 100 mM NaPP, 500 μl of 1 M NaF, and 1 ml of 1 M Tris–HCl, pH 8.0 stock solution. Adjust volume to 100 ml with water; keep the solution on ice until use.
  • P2 buffer (0.32 M sucrose, 1.5 μM pepstatin A, 0.75 μM aprotinin, 8 μM leupeptin, 1 μM trypsin inhibitor, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0.2 mM PMSF, 1 mM NaPP, 5 mM NaF, 10 mM Tris–HCl, pH 8.0): to make 100 ml of P2 buffer, weigh 11 g sucrose and dilute it in 90 ml of deionized water, add protease and phosphatase inhibitors using stock solutions—100 μl of 1.5 mM pepstatin A, 50 μl of 1.5 mM aprotinin, 40 μl of 20 mM leupeptin, 200 μl of 0.5 mM trypsin inhibitor, 100 μl of 0.2 M EDTA, 100 μl of 0.2 M EGTA, 200 μl of 100 mM PMSF, 1 ml of 100 mM NaPP, 500 μl of 1 M NaF, and 1 ml of 1 M Tris–HCl, pH 8.0.
2、P2染色试剂
  • Phosphate buffered saline (PBS): 0.01 M phosphate buffer, 0.0027 M potassium chloride, and 0.137 M sodium chloride, pH 7.4 (see Note 3).
  • 4 % paraformaldehyde (PFA) stock solution: weigh 2 g of paraformaldehyde, move it into 50 ml centrifuge tube, add PBS to reach 50 ml total volume, close and seal the tube with Parafilm and incubate overnight into water bath (55 °C). Next day let the solution to cool down to room temperature, recheck pH and adjust it to 7.4 if required. Filter the solution through 0.45 μm filter and store at 4 °C (stable for 6 months).
  • Fixation buffer (0.25 % PFA in PBS, pH 7.4): add 625 μl of PFA stock solution to 9 ml 375 μl of PBS, vortex. Prepare fixation buffer fresh right before fixation step.
  • 10 % Tween 20 stock solution: add 1 ml or 100 % Tween 20 (see Note 4) to 9 ml of water, invert tube several times to mix, store at room temperature, protect from light (the solution is stable for a month).
  • Permeabilization buffer (0.2 % Tween 20 in PBS): add 1 ml of 10 % Tween 20 stock solution to 49 ml of PBS. Invert tube or slightly vortex to mix.
  • Immunostaining/Blocking Buffer (2 % fetal bovine serum (FBS) in PBS, pH 7.4): add 40 μl of FBS to 960 μl of PBS, pH 7.4. Invert tube or slightly vortex to mix.
  • Washing buffer (0.1 % tween 20 in PBS): add 500 μl of 10 % Tween 20 stock solution to 49 ml of PBS. Invert tube or slightly vortex to mix.
  • Tau/ptau-specific antibodies and isotype control antibodies.
  • Presynaptic marker-specific antibody (for example, SNAP25, or Synaptophysin, or VGluT1-specific antibody).
  • Isotype control antibodies.
  • Zenon kits. Particular Zenon kits need to be selected based on the primary antibody host, isotype and suitable fluorophore type.
  • Polystyrene beads with 0.75, 1.5 and 4.5 μm in diameter.

步骤
1、人脑组织冷冻保存
  • 制作低温保存缓冲液,并将其放在冰上冷藏。
  • 称重新鲜的脑组织,并根据1:10的质量与体积比(1克新鲜组织+10毫升低温保存缓冲液)计算低温保存缓冲液的体积。
  • 将脑组织放入培养皿中,并加入2毫升冰冷的低温保存缓冲液。将组织切成1-3毫米的碎片,使用预冷的手术刀。
  • 将切碎的组织和缓冲液转移到一个15毫升或50毫升带盖离心管中,并加入其余的低温保存缓冲液与抑制剂。
  • 将管子放入带有绝缘材料的泡沫塑料盒中,缓慢冷冻至-80℃。
2、突触体(P2)组分的制备和低温保存
  • 从-80℃的冰箱中取出一管含有低温保存的脑组织,并放置在温水浴(37℃)中1-2分钟以解冻。
  • 与5倍体积的冰冷P2缓冲液混合,并大力摇动,直到组织松散。
  • 离心机混合2分钟,在1000×g,4℃,以沉淀颗粒化的脑组织。
  • 混合颗粒与10体积的P2缓冲液(根据冻存前新鲜组织的重量计算)。
  • 使用特氟龙/玻璃均质器(间隙0.1-0.15毫米)制备匀浆。
  • 在1000×g,4℃,离心10分钟,以分离细胞碎片和细胞核(P1部分)。
  • 收集上清液(S1),将其放入干净的预称重离心管中,并在10,000×g,4℃下离心20分钟,以获得突触体P2粗颗粒。
  • 小心地丢弃上清液(S2),称量P2颗粒。
  • 以10倍(质量体积比)体积的P2缓冲液重悬P2颗粒。
  • 将重悬的P2部分按500μl等分。
  • 将管子放入带有保温材料的泡沫塑料盒中,缓慢冷冻至-80℃。
3、P2组分的免疫染色
  • 从-80℃取出P2组分,并立即在温水浴(37℃)中解冻1-2分钟。
  • 将P2组分转移到含有等体积的冰冷的PBS管中,并通过移液器上下几次轻轻混合。
  • 在4000×g(4℃)离心4分钟,以沉淀P2部分。
  • 去上清,用固定液重悬,在4℃下孵育1小时。
  • 在4000×g(4℃)离心4分钟,以沉淀P2部分。
  • 去上清。
  • 用500μl破膜缓冲液重悬固定的P2组分。
  • 将管放入水浴中(37℃),孵育15分钟,每5分钟倒置一次。
  • 加入500μl的PBS,在4000×g(4℃)离心4分钟,沉淀P2部分。去上清。
(制备荧光素结合的抗体)
  • 每管样本制备需要18微升的免疫染色/阻断缓冲液与1微克的特异性抗体或同型对照抗体。
  • 加入4.2微升对应的Zenon试剂盒溶液A(Fab片段与共轭Alexa染料)的抗体,并在室温下孵育5分钟,避光。
  • 加入4.2μl的Zenon试剂盒溶液B(终止溶液)的抗体/溶液A的混合物,并在室温下孵育5分钟,避光。
  • 将5μl的P2组分转到一个新的管子中。加入25μl刚才制备好的荧光素结合抗体或25μl免疫染色/阻断缓冲液(空白对照)到管中,混匀并在室温下孵育30分钟,避光。
  • 加入1毫升洗涤缓冲液到每个反应中,混匀并在4000×g(4℃)离心4分钟。
  • 重复洗涤步骤2次,避光。
  • 重悬在洗涤缓冲液中的免疫染色P2馏分,并转移到FACS管,避光。
4、流式上机获取 先跑0.75、1.5、4.5 μm微球,确定位置。然后上阴性对照、阳性对照、样本,获取0.75~1.5μm范围内的信号,获取5000~10000个,按下图分析:
nihms926400f2.jpg

就这样简单,流式就能快速检测Tau蛋白等突触内蛋白。

参考文献:Gylys KH, Bilousova T. Flow Cytometry Analysis and Quantitative Characterization of Tau in Synaptosomes from Alzheimer's Disease Brains. Methods Mol Biol. 2017;1523:273-284. doi:10.1007/978-1-4939-6598-4_16

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