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磷酸化蛋白流式经验分享

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 楼主| 发表于 2020-10-24 20:48:24 | 显示全部楼层 |阅读模式

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实验需要涉及到磷酸化的STING蛋白,对的,就是很火的cGAS-STING通路。胞内磷酸化蛋白一般都是用WB做,很少有人去做流式,为了丰富数据,我决定尝试一下。但是看了群里面的经验,发现主要是用甲醇固定破膜,所以我第一步首先用甲醇破膜,先看看效果。


结果却相当的不如人意,细胞碎得一塌糊涂,分群也特别不明显。
结果如下
流式-1.png


可以很明显的看到,细胞已经稀碎,这对后面的结果也会带来不小的影响。

流式-2.png 流式-3.png
左边是对照,右边 是处理组,这么一点点,到底是有还是没有呢。。。我陷入了迷茫。


后来,在很多技术细节不断地改进,例如,这是铁壁细胞,消化的时候,用胰蛋白酶轻轻地消化到细胞变圆,但是还没有脱落的状态,弃去消化液,直接上固定液(因为没有染表面蛋白,只染胞内的p-STING。)等等,一系列改进,最后变成这样:
流式-4.png 流式-5.png

现在这个比例基本上可用了。但是我依然不满意,于是继续换,尝试了BD的破膜液,效果也一般,以及自己配置的皂素,NP-40等破膜剂,效果还不如之前。这里略去不谈了。

重点来了,最后更换了细胞,并更换了ebioscience的FOXP3破膜液,效果一下出来了。
结果如下:
流式-8.png 流式-7.png


可以看到,阳性群比之前高了一个数量级,这和我WB结果基本吻合了,这样有了WB和流式数据的相互验证,数据可信度高了不少。
另外:
流式-9.png

细胞的形态也比之前甲醇破膜的好了太多。

前后来来回回折腾了一个多月,经历了二十次实验,最后终于得到比较理想的结果。
感想就是,找到合适的破膜剂以及细节改进小技巧。还有就是,能更换细胞系就可以尝试更换一下,别在一棵树上吊死

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你知道活性/增殖/凋亡/焦亡/自噬的区别吗?——点击了解细胞健康检测全面方案
 楼主| 发表于 2021-7-25 00:23:34 | 显示全部楼层
stf1990 发表于 2021-7-20 21:15
你好站友, 我也是用的ebioscience 的Foxp3破膜套装,concentrate:diluent=1:3, 总体系200ul/tube。  ...

时间太长了,可以先摸索一下,个人建议根据细胞的不同,30-45min吧,太久了容易碎。而且量也可以适当减少,我一般200ul就可以了
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2020-10-24 20:52:11 | 显示全部楼层
哎,对这个插入图片不熟悉,插图片折腾了好久,如果大家看图有问题,欢迎call我
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 楼主| 发表于 2020-10-24 20:56:52 | 显示全部楼层
暂时还不能告诉大家这是什么具体的细胞,因为特征太明显,我的课题还在推进中,等后续实验差不多结束,我会把所有涉及到流式的经验一一发表成帖子。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2020-10-24 22:29:51 | 显示全部楼层
这是非常有意义的经验分享,感谢,加星鼓励。
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发表于 2021-6-21 21:12:23 | 显示全部楼层
请问有没有更详细一点的protocol,我们实验室正好也是ebioscience的FOXP3破膜试剂
你知道活性/增殖/凋亡/焦亡/自噬的区别吗?——点击了解细胞健康检测全面方案
发表于 2021-6-22 07:51:31 | 显示全部楼层
scaleus 发表于 2021-6-21 21:12
请问有没有更详细一点的protocol,我们实验室正好也是ebioscience的FOXP3破膜试剂 ...

按试剂盒的protocol即可。
你知道活性/增殖/凋亡/焦亡/自噬的区别吗?——点击了解细胞健康检测全面方案
发表于 2021-7-13 15:56:55 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-6-22 07:51
按试剂盒的protocol即可。

倪老师,FOXP3的破膜剂与常规检测细胞因子的破膜kit区别是啥?
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发表于 2021-7-13 16:00:14 | 显示全部楼层
stf1990 发表于 2021-7-13 15:56
倪老师,FOXP3的破膜剂与常规检测细胞因子的破膜kit区别是啥?

可破核膜。穿孔能力更强。
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发表于 2021-7-20 21:15:44 | 显示全部楼层
麦小光 发表于 2020-10-24 20:52
哎,对这个插入图片不熟悉,插图片折腾了好久,如果大家看图有问题,欢迎call我 ...

你好站友, 我也是用的ebioscience 的Foxp3破膜套装,concentrate:diluent=1:3, 总体系200ul/tube。 但是2至8度破膜60分钟后,用buffer洗完,试管底部能看到明显的细胞碎片,这是破膜时间太长的缘故吗?
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