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[标本处理] 急!求助!pSTAT5染色见不到荧光信号,希望经验丰富的老.....

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 楼主| 发表于 2020-11-26 15:36:52 | 显示全部楼层 |阅读模式
40流星
我们的实验是用IL2诱导hPBMC细胞,希望检测到下游pstat5的变化,这个实验已经做了好久了,一直都是几乎染不上颜色,尝试了很多条件、很多试剂,都没有太大改善,现在完全没有头绪,不知道该怎么把这个实验做下去了,希望有经验丰富的老师能给我们指点一下方向!不胜感激!!详细的各个细节如下,有任何问题欢迎留言。
1、关于样本:我们目前使用的样本包含hPBMC和一株永生化的肿瘤细胞,都有文献证明其pSTAT5是激活的,并且同样的样本及诱导条件下我们使用ELISA检测到了其正确的磷酸化表达趋势;
2、关于固定:我们使用的是BD的商品化固定试剂,其主要成分是甲醛,是抗体推荐使用的固定试剂;
使用的方法是直接加入与培养基等量的固定液(200ul+200ul),37℃固定10min(该方案为BD试剂说明书提供);
这一步我们也尝试过使用1%的多聚甲醛室温固定10min,以及BD试剂冰上固定10min,(因为网上有观点认为固定是一个放热反应),但是没有见到明显改善;
3、关于破膜:我们使用的是BD perm Ⅲ破膜试剂,(主要成分是甲醇,高达80%多),1*10^6个细胞我们使用了1ml破膜试剂,冰上破膜30min;
我们也使用过自己实验室配制的0.5%Triton X-100,80%的甲醇试剂,以及bioscience的破膜试剂,结果没有明显区别;
4、关于抗体:我们使用过两种pSTAT5抗体,都是BD的抗体,是文献上报道使用过的克隆号,两种荧光基团,有一株perCP-cy5.5,一个是Alexa Fluor 680;
抗体的浓度的话,我们最高的时候用到过1:5的浓度,也未见染色;
我们的CD3也使用的BD抗体,FITC荧光基团;
5、关于染色:我们是同时染了CD3和pSTAT5两个信号,尝试过先染CD3再破膜再染pSTAT5,也尝试过破膜后同时染CD3和pSTAT5,都是能染上CD3,但是没有pSTAT5信号;
我们稀释抗体和每一步之间的洗涤都是用的PBA缓冲液(2%FBS in PBS);
6、关于洗涤与重悬:我们洗涤使用的提前预冷的PBA,所有操作都是在冰上完成的,离心条件是4℃ 500~700g 离心5~10min;
重悬我们一般是将液体加入EP管以后,用手弹混悬充分(这里我们曾经怀疑过重悬不充分,所以取了混悬的样本到显微镜下观察,可以看见已经重悬成单个细胞了);(使用弹匀的方式主要是有说法是抗体吹洗会造成细胞损伤);
7、关于流式仪器:我们已经使用过两台不同的仪器检测过了,没有太多差别;各项参数都确认过了,电压有点稍微偏高。
8、典型的实验结果如下图:
11.png 22.png

发表于 2020-11-27 20:43:43 | 显示全部楼层
pSTAT5很难测,市场上我记得有专门的用于磷酸化蛋白检测的破膜剂的。
 楼主| 发表于 2020-11-30 13:33:43 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-11-27 20:43
pSTAT5很难测,市场上我记得有专门的用于磷酸化蛋白检测的破膜剂的。

老师您好,我们目前使用过的两款商品化破膜试剂都是针对磷酸化的,我们也尝试使用过网上的一些配方,都改善不大。
有没有可能不是破膜的问题?其他环节有没有需要特别注意的地方呢
发表于 2020-11-30 14:08:15 | 显示全部楼层
LINGHQ 发表于 2020-11-30 13:33
老师您好,我们目前使用过的两款商品化破膜试剂都是针对磷酸化的,我们也尝试使用过网上的一些配方,都改 ...

目前从你描述的这些步骤来看,似乎你们都考虑到了。但这样还是做不出来,实在是有点奇怪。
至于更多的细节,还真说不出来,就像我们平时做免疫分型的时候,有些同事就是做不好,但问到细节,都说做的好的。可能真有哪个细节出了遗漏或疏忽。
发表于 2020-11-30 14:55:10 | 显示全部楼层
LINGHQ 发表于 2020-11-30 13:33
老师您好,我们目前使用过的两款商品化破膜试剂都是针对磷酸化的,我们也尝试使用过网上的一些配方,都改 ...

用破膜剂洗涤,破膜剂重悬孵抗体,再试试。估计可以做出来
 楼主| 发表于 2020-12-1 12:56:17 | 显示全部楼层
tiger 发表于 2020-11-30 14:55
用破膜剂洗涤,破膜剂重悬孵抗体,再试试。估计可以做出来

老师您好,万分感激您提供的方案,破膜剂洗涤、破膜剂重悬孵育抗体,我的理解就是抗体放到破膜剂中染色,不知道对不对哈,我们会尽快安排实验一下的;
但是如果是这样的话,我有一个点比较担心,因为破膜剂的主要成分是甲醇(80%),而甲醇会使蛋白质沉降、变性,不知道对抗体的活力有多大影响呢?会不会由于抗体变性产生非特异的结果呢?
 楼主| 发表于 2020-12-1 12:57:27 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2020-11-30 14:08
目前从你描述的这些步骤来看,似乎你们都考虑到了。但这样还是做不出来,实在是有点奇怪。
至于更多的细 ...

感谢老师,我们会再严格的自查的,希望能找到原因
发表于 2020-12-3 18:47:00 | 显示全部楼层
LINGHQ 发表于 2020-12-1 12:57
感谢老师,我们会再严格的自查的,希望能找到原因

现在实验结果怎么样呀,我最近也在做,实验步骤和你是一样的,前期预实验时可以明显做出来,后期做stat5磷酸化结果下降挺多的,不确定什么原因
发表于 2020-12-3 18:53:24 | 显示全部楼层
关于染色:我同时染色更多,其中也有CD3和pSTAT5两个信号,尝试过先染CD3再破膜再染pSTAT5,也尝试过破膜后同时染CD3和pSTAT5,并且对比过,如果先固定破膜会导致所有PBMC都染上CD3,不过看过一些文献专利上可以固定破膜后染色,用的和你的试剂都是一样的,
发表于 2020-12-3 21:09:13 | 显示全部楼层
LINGHQ 发表于 2020-12-1 12:56
老师您好,万分感激您提供的方案,破膜剂洗涤、破膜剂重悬孵育抗体,我的理解就是抗体放到破膜剂中染色, ...

@tiger  指的是非甲醇类的破膜剂。
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