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[标本处理] 小鼠皮下瘤免疫细胞流式结果分析

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 楼主| 发表于 2021-1-5 21:03:30 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
本帖最后由 Reyna 于 2021-1-6 23:13 编辑

各位老师好,本人最近做了一批小鼠,实验方案是取C57小鼠MC38细胞皮下瘤剪碎,用胶原酶I(2mg/ml),胶原酶IV(2mg/ml),DNaseI(0.2mg/ml)消化1个小时左右(实际上只在37℃敷箱里消化了30-40分钟,后面因为吃饭先把细胞放冰上了再处理的)制作单细胞悬液,用流式抗体Alexa Fluor® 700 CD3ε、FITC CD4、APC CD8a、Brilliant Violet 510™ CD19、Brilliant Violet 421™ NK-1.1、PerCP/Cyanine5.5 CD11b、PE F4/80、Brilliant Violet 605™ CD11c、PE/Cyanine7 CD45、Zombie NIR™ Fixable Viability Kit十色放一管里不分组染色标记CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、NK细胞、TAM、DC细胞,看各处理组免疫细胞比例的差异,上机这块流式实验方案是之前建立好了,并且已经请公共平台的老师调过补偿了的,固定过后第二天直接上机测的,拿到数据分析过程中还是有两点疑惑,希望各位老师能够解答。

1、对于CD45这种分群很明显的我可以直接如下图所示圈门

CD45圈门

CD45圈门

但对于分群不明显的,表达高的,如CD3该怎么圈门?

CD3

CD3

以及分群不明显的,表达低的,如CD19、NK1.1,又该如何确定门的位置?

CD19圈门

CD19圈门
     

NK1.1圈门

NK1.1圈门


我自己目前圈门的策略是FSC-H\FSC-A 去粘连,FSC-A\SSA-A基本上全勾选(考虑到巨噬细胞),然后是死活,然后是CD45,各个细胞染色的门之前是根据BLANK(细胞只固定没染色)各个染料的阴性范围画的门,但是对于有些样本门是明显偏离了主群细胞的,所以我又每个样本靠着感觉画门,但这样的话就太主观了,希望老师们能给出建议。

2、我还有个问题就是,我重复了好几次,我的CD4+T淋巴细胞总是远远比CD8+淋巴细胞少,按理说CD4+T细胞应该比CD8+T细胞多才对,而且我查阅的文献也是皮下瘤中CD4+T细胞多,所以我就是不知道问题出在哪里,CD4用脾细胞单染分群明显是没问题的,但是染皮下瘤的时候总是染不出来,并且我在CD45阳性的细胞里直接看CD4+的细胞也很少,不知道是我消化的问题还是说这个抗体本身的问题

CD4CD8圈门

CD4CD8圈门




发表于 2021-1-5 21:21:17 | 显示全部楼层
你的图片怎么用BASE64编码?这样显示不完整的。请编辑帖子,利用编辑器的工具栏上图片上传按钮上传吧。
 楼主| 发表于 2021-1-5 21:23:56 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-1-5 21:21
你的图片怎么用BASE64编码?这样显示不完整的。请编辑帖子,利用编辑器的工具栏上图片上传按钮上传吧。 ...

好的,谢谢倪老师提醒,我是直接截图后粘贴的,现在重新上传!
发表于 2021-1-6 08:11:47 | 显示全部楼层
1、有没有试过通过CD3、CD19、NK1.1、CD11b等标记的反设门,来确定CD45的位置。看这里的CD19、CD3都没有明显分群,感觉是不是细胞被消化过度了?还是电压偏低?
2、CD4远少于CD8的话,我考虑还是跟第1个问题类似的根源,先从样本处理上找一下问题吧。
 楼主| 发表于 2021-1-6 13:20:02 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-1-6 08:11
1、有没有试过通过CD3、CD19、NK1.1、CD11b等标记的反设门,来确定CD45的位置。看这里的CD19、CD3都没有明 ...

好的,谢谢倪老师的指导,我后面再优化一下处理条件!
发表于 2021-1-6 14:31:09 | 显示全部楼层
我这里看的就不完整,显示有隐藏信息,需要回复后才能查看
 楼主| 发表于 2021-1-6 23:07:34 | 显示全部楼层
本帖最后由 Reyna 于 2021-1-6 23:14 编辑

@niwanmao 感谢倪老师的回复,我用了CD3、CD19、NK1.1来看CD45的位置,发现有的样本之前CD45是有些没圈进去,而且FSC/SSC我也圈大了,但再仔细看这些目标细胞的位置不在CD45单独分出来的那个群,而在肿瘤实体细胞那个大群中,而且我的CD4更明显,还出现了双阳性细胞,反向圈门后看到这群双阳性细胞也是主要集中在实体细胞群,那我圈CD45究竟是按现在这样两群都圈还是说只圈分出去的那群细胞呢?

第一组分析-Layout.pdf

2.29 MB, 阅读权限: 10, 下载次数: 17

CD3、CD4、CD8

第一组分析-Layout-2.pdf

869.01 KB, 阅读权限: 10, 下载次数: 6

CD19、NK1.1

 楼主| 发表于 2021-1-6 23:14:20 | 显示全部楼层
gaocx 发表于 2021-1-6 14:31
我这里看的就不完整,显示有隐藏信息,需要回复后才能查看

之前把内容隐藏了,现在可以了!
发表于 2021-1-7 07:40:40 | 显示全部楼层
Reyna 发表于 2021-1-6 23:07
@niwanmao 感谢倪老师的回复,我用了CD3、CD19、NK1.1来看CD45的位置,发现有的样本之前CD45是有些没圈进去 ...

我看这里的图都是以单参数+SSC或FSC显示,能否改成各荧光抗体的两两组合的散点图,看一下相互之间的补偿,我总觉得很多非特异性信号。
 楼主| 发表于 2021-1-8 16:14:38 | 显示全部楼层
本帖最后由 Reyna 于 2021-1-8 20:49 编辑

@niwanmao 倪老师,我把荧光图改成了CD45和CD3、CD19、NK1.1的两两组合的散点图,您看下有什么问题么?
第一组分析-Layout-3.jpg
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