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[流式分选] 原代细胞流式分选后做RNA提取,样品制备过程应该注意哪...

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 楼主| 发表于 2021-1-6 14:21:52 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
我近期需要将小鼠肺组织细胞提取后,用流式分选其中的部分细胞,进行后续的RNA-seq。

由于我还没做过分选,想请教一下大家:
1)是不是细胞提取、染色过程都应该去除RNase,我目前看了几篇文献,倒是都没有刻意指出要去除
2)细胞提取过程是不是越快越好呢?我的样品比较多,提取加染完一般都傍晚了,再过夜是不是不太好?
3)收集液用什么比较好?我看到有的文献直接用了trizol,但分选出来的细胞不是带有鞘液吗,会不会有影响?

发表于 2021-1-6 16:26:49 | 显示全部楼层
首先说明一下,我没做过,纯粹从理论上进行讨论,如有不当之处,请有经验的FLOWER指出。

1、我觉得应该要加,至于文献未指出,是否与写文章的人有时候不一定是操作者,在某些细节上不一定描述到位?
2、提取过程肯定是越快越好,为了速度起见,是否有可能减少一次处理的样本数呢?
3、收集液,平时看到的资料一般是「含有RNase抑制剂的裂解液」,Trizol是可以的,主要是为了避免RNA降解,同时起到一定裂解作用,加速后续步骤,所以稀释是次要的。

以上意见,仅供参考。
 楼主| 发表于 2021-1-6 17:20:17 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-1-6 16:26
首先说明一下,我没做过,纯粹从理论上进行讨论,如有不当之处,请有经验的FLOWER指出。

1、我觉得应该要 ...

收到,谢谢倪老师!
 楼主| 发表于 2021-1-6 17:27:15 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-1-6 16:26
首先说明一下,我没做过,纯粹从理论上进行讨论,如有不当之处,请有经验的FLOWER指出。

1、我觉得应该要 ...

还想请教一下倪老师,我的细胞比例较低,是否需要预先用MACS纯化一下再进行分选?只是我们的MACS比较缓慢,是用柱子的那种。

所以我们是应该把分选的时间放在MACS上还是FACS上呢?
发表于 2021-1-7 07:31:43 | 显示全部楼层
gaocx 发表于 2021-1-6 17:27
还想请教一下倪老师,我的细胞比例较低,是否需要预先用MACS纯化一下再进行分选?只是我们的MACS比较缓慢 ...

流式是能够直接进行稀有细胞的分选的,我个人觉得还是直接用流式分选比较好一点,否则先磁珠,再流式,这中间的过程更长了,反而影响细胞得率和活力。
发表于 2021-1-9 11:35:17 | 显示全部楼层
本帖最后由 TMU-1107 于 2021-1-9 11:51 编辑

楼主,倪老师好,流式小白一个,目前也是想分选出某一细胞后做测序,请问用死活染料PI染细胞我看是不能洗,直接上机,但PI时间久了对细胞活力也有伤害,是先染完我的Marker之后再染PI上机分选?那分选过程中我的活性不好的细胞会不会持续增加,影响收集到的细胞数目。如果我不染这个死活染料,直接染Marker分选可行吗,会影响后续测序质检吗?谢谢。还有就是PI是不是和PE广泛交叠,我的Marker分别选的是PE和APC,PI和PE的还可以区分吗?学校的分选仪器是BD FACS AriaⅡ。
发表于 2021-1-9 12:44:01 | 显示全部楼层
TMU-1107 发表于 2021-1-9 11:35
楼主,倪老师好,流式小白一个,目前也是想分选出某一细胞后做测序,请问用死活染料PI染细胞我看是不能洗, ...

如果是新鲜样本,并且是血样,一般不染死活染料问题也不大,因为活性有保障。
如果是组织样本,建议还是染一下死活。PI不要与PE一起用,你可以买商品化死活染料(像Live/dead、Zombie、Ghost等都可以有多种激发波长和发射波长可选)。
发表于 2021-1-9 13:44:43 | 显示全部楼层
本帖最后由 TMU-1107 于 2021-1-9 13:46 编辑
niwanmao 发表于 2021-1-9 12:44
如果是新鲜样本,并且是血样,一般不染死活染料问题也不大,因为活性有保障。
如果是组织样本,建议还是 ...

嗷嗷,好的,谢谢倪老师。我们是组织样本,那就需要染一下了。还有一个问题是,我是两个Marker分选细胞,分组应该是①空白组②单染Marker-1③单染Marker-2④双染Marker1+2,这四组的前提是不是都是先染了死活染料,还有您提到的Zombie.我的Marker分别是PE和APC,那Zombie是不是选那个
UV是合适的,如果我着急用,能借到的是NIR,平行荧光素是APC/Cy7,这个会和MarkerAPC串吗?谢谢您
Zombie.png
发表于 2021-1-9 22:56:36 | 显示全部楼层
TMU-1107 发表于 2021-1-9 13:44
嗷嗷,好的,谢谢倪老师。我们是组织样本,那就需要染一下了。还有一个问题是,我是两个Marker分选细胞, ...

补偿不可怕,都能调好。只要不重叠即可。
发表于 2021-1-9 23:15:50 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-1-9 22:56
补偿不可怕,都能调好。只要不重叠即可。

谢谢您,倪老师
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