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[淋巴细胞相关] 脾淋巴细胞刺激实验中,PBS组CD69跟ConA组表达差不多,怎么办

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 楼主| 发表于 2021-1-7 15:53:50 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
我是通过裂红素提取小鼠脾淋巴细胞的,这边的细胞活率比较低,不知道会不会有影响。刺激的时候用的是终浓度10ug/mL的ConA,还加了CD28/CD49d,培养箱孵育了5小时。孵抗体前也加了CD16/32进行封闭,然后再孵的CD4(FITC)和CD69(AF700)抗体。上机检测的时候发现没加ConA刺激的细胞,CD69表达水平基本是跟加了ConA一样的,我就很纳闷,优化重复了好几次都这样,也不知道是PBS组假阳性还是ConA组根本没刺激起来?求指点

PBS组

PBS组

ConA组

ConA组

发表于 2021-1-8 10:38:41 | 显示全部楼层
激活了的细胞体积和形态都有变化,也就是你第二组淋巴细胞圈门的右边的那一群细胞,你没圈进去肯定看不到CD69的变化
发表于 2021-1-8 12:52:56 | 显示全部楼层
看上去应该是PBS组偏高,是不是PBS内混入了ConA ?或者两管处理时混一起了?
 楼主| 发表于 2021-1-10 11:20:48 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-1-8 12:52
看上去应该是PBS组偏高,是不是PBS内混入了ConA ?或者两管处理时混一起了? ...

这个没有,我尝试了好几次,都这样。
 楼主| 发表于 2021-1-10 11:24:24 | 显示全部楼层
Mgaxw 发表于 2021-1-8 10:38
激活了的细胞体积和形态都有变化,也就是你第二组淋巴细胞圈门的右边的那一群细胞,你没圈进去肯定看不到CD ...

感谢回复,我尝试了一下你说,圈进去后的变化不大,可能是它本身比例就比较少,可是文献中刺激后的CD69阳性群体应该是很明显的。
 楼主| 发表于 2021-1-10 11:25:26 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-1-8 12:52
看上去应该是PBS组偏高,是不是PBS内混入了ConA ?或者两管处理时混一起了? ...

老师你好,我现在是在怀疑会不会其实都是阴性,只不过是我电压调的有点大,导致都呈假阳性了。
发表于 2021-1-10 18:31:03 | 显示全部楼层
范小亿 发表于 2021-1-10 11:25
老师你好,我现在是在怀疑会不会其实都是阴性,只不过是我电压调的有点大,导致都呈假阳性了。 ...

但是看有比较明显的分群,似乎是真阳。不过你下次用一管不染色的细胞,确定一下电压是否存在过高的可能。
发表于 2021-1-11 08:58:48 | 显示全部楼层
范小亿 发表于 2021-1-10 11:24
感谢回复,我尝试了一下你说,圈进去后的变化不大,可能是它本身比例就比较少,可是文献中刺激后的CD69阳 ...

那你可以试着把时间在12h和24h测一下,我们用1ug和5ug/mL的ConA都能看到很明显的活化,圈门的时候要把右边体积增大的细胞一起圈进去
 楼主| 发表于 2021-1-11 16:02:15 | 显示全部楼层
Mgaxw 发表于 2021-1-11 08:58
那你可以试着把时间在12h和24h测一下,我们用1ug和5ug/mL的ConA都能看到很明显的活化,圈门的时候要把右 ...

好的,我试试看,非常感谢!
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