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分享几个染色技巧和样本保存秘招

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 楼主| 发表于 2021-1-22 16:29:15 | 显示全部楼层 |阅读模式

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如果可能,应在活细胞上对表面分子进行染色,以避免预处理步骤(例如细胞固定或细胞破膜)可能引入的任何抗原变性,以清楚地区分细胞内和细胞外定位。

对于同时进行细胞内和表面染色,应先对表面标志物进行染色,然后在对细胞内抗原染色之前先进行固定和破膜。

当细胞确实表达高或低亲和力的Ig Fc受体(例如CD64或CD32)时,应尽可能使用能减少“非特异性”相互作用的重组抗体。

在阻断试剂(例如纯化的Ig)存在下孵育细胞,可以抑制Fc受体介导的免疫球蛋白的非特异性结合。

与血细胞或液体渗出液中的细胞不同,组织中的原代细胞通常需要进行酶解预处理以使组织解离,从而最终获得悬浮的单细胞。但是在此过程中,表面蛋白的抗原性也会受到影响。因此,根据组织类型和感兴趣的细胞,必须仔细确定酶消化的条件。通常,存在多种可用的酶,例如弹性蛋白酶,透明质酸酶,分散酶和不同类型的胶原酶。它们的消化特性不同,因此,就细胞活力、细胞产量和抗原的保存(必须由FCM研究)而言,必须优化孵育时间,温度和酶浓度。
参见:最完整的实体组织酶消化指导手册
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html
(出处: 流式中文网)

对于在组织消化过程中被破坏的非常敏感的抗原,可以将分离的细胞培养过夜,以使受影响的细胞表面蛋白重新表达。原则上,酶促组织消化后获得的细胞比悬浮细胞承受的压力要大得多,因此,分析时需要用死活染料排除死细胞。

尽管理想情况下应使用新鲜样品进行流式细胞仪分析,但目前还是有几种方法可以稳定样本的。
- Ficoll 70 kDa可将血液短期保存长达24小时,其主要目的是抑制由RBC聚集引起的血液沉降诱导的应激。
- 对于长期存储,PBMC的超低温保存是另一种选择。 但应记住,此过程会对某些表面分子(例如CD62L或趋化因子受体)产生负面影响。
- 可用于血液样本长期存储的商品化保存液,例如TransFix、Cyto-Chex BCT、Smart Tube。 后者甚至允许在经过适当处理后分析冷冻血样而不会丢失粒细胞。 但是对于所有这些稳定方案,强烈建议对它们进行彻底的验证以用于感兴趣的表面标记。 这里需要着重提一下我们流式中文网自己研发的「FlowGuard」流式专用保存液,既可明显减轻血样溶血,又对抗原表达强度和FSC保留相当完美,质量不弱于进口,价格仅为进口的1/10,下面是我们在一例临床骨髓样本中的保存对比(左侧列为新鲜样本,中间列为加了FlowGuard®保存液4度保存10天的结果,右侧列为不加保存液4度保存10天的结果):
对比_352.jpeg 对比_352 2.jpeg


如果大家对保存液感兴趣,可访问 https://kdt.im/PhQvsr 购买 。


活细胞可能在长时间的体外处理过程中发生死亡,或者可能主动内化表面分子或将其从表面脱落,所以,用抗体标记后,可以通过温和的处理手法来避免这种情况,例如,小心地进行移液、处理时间短、低温(在冰上)或在染色缓冲液中添加叠氮化钠,这会阻止分子的脱落/内在化。 染色后,应立即分析细胞或将其严格保存在冰上和避光。



节选自:Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur. J. Immunol. 2019. 49: 1457–1973
发表于 2021-1-23 11:03:26 | 显示全部楼层
倪老师,这句话能再解释下是什么意思吗?一般避免非特异性结合,使用Fc封闭就可以了,您里面提到的重组抗体是什么意思?
当细胞确实表达高或低亲和力的Ig Fc受体(例如CD64或CD32)时,应尽可能使用能减少“非特异性”相互作用的重组抗体。
 楼主| 发表于 2021-1-24 09:13:13 | 显示全部楼层
wmj123456 发表于 2021-1-23 11:03
倪老师,这句话能再解释下是什么意思吗?一般避免非特异性结合,使用Fc封闭就可以了,您里面提到的重组抗体 ...

重组抗体是利用基因工程做出来的抗体,不是常规用抗原免疫出的,所以批间差非常小,而且在结构设计的时候,就尽量排除了那些非特异性结合的可能性。
发表于 2021-1-30 17:26:40 | 显示全部楼层
接上面的问题,我也想请教一下如果目的是要检测CD32 CD64这样的分子,那如何避免抗体Fc端与CD32 CD64的结合?(这应该就是非特异性结合)
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