外周血流式样本处理、抗体选择和补偿调节的问题

ishine119

最近在做外周血的流式，因为实验室之前没有做过，是自己建立摸索的方法，感觉有好多问题。先放在一个帖子里了，感觉比较容易看，如果不合适的话再重新发帖。先谢谢各位啦。

基本信息：

样品前处理方法：

预实验，所以小鼠没有经过其他处理。只是单笼饲养可能有轻微应激。

小鼠断尾取血100 μL，3000 rpm离心取血浆后（其他实验需要），5 mL RBC裂解红细胞5 min后等体积PBS中和，弃上清。沉淀以5% BSA PBS洗涤后，100 μL PBS重悬，CD16/32 抗体封闭15 min。洗涤后分两份（另一份染别的配色了），100 μL PBS体系染色20 min。洗涤上机。

抗体事先均经过滴定（但是只滴定了推荐浓度的0.5倍、1倍和1.5倍浓度，感觉差别不大，所以最后遵循了表达高的分子可以用低一点，表达不高的分子用推荐浓度这样的方法。）

配色方案如下：

图1（抗体选择）

分群设计如下：

图2（分群marker 设计）

问题：

1、配色和分群的设计有没有大的问题呢？我知道Th1和Th17用CXCR3和CCR6标记并不是最优的选择，但是这个细胞量做刺激和破膜不太现实。配色是自己配的，不知道有没有硬伤。

另外因为样品是100 μL的全血分了两份染，抗体浓度是按照推荐浓度来比较好呢，还是按照推荐浓度的一半比较好？滴定的分群没有特别明显的区别，但是考虑到染色体积还是100 μL，很多还是没有减半。不知道这个取舍怎么做比较好呢？

2、看FSC/SSC图，发现部分样品典型的粒细胞群似乎比较理论要少（印象中粒细胞应该是白细胞中最多的一部分？），请问这个情况是不是和我的样品前处理有很大的关系呢？怀疑是血液抗凝那一步的问题，但是不是特别确定。

图3（外周血FSC-SSC）

3、补偿调节是否合理？

在机器自动调节的补偿基础上又进行了微调。但是总有些对角线上的细胞调不下去。想要请教一下如何调节这部分补偿。

图4（补偿调节前后）

图5（补偿调节前后2）

图6（补偿调节后）

4、NK1.1阳性的细胞群中有一大部分是CD19阳性的。做了FMO看，这个补偿下NK1.1(PerCP-Cy5.5)应该是没有漏到CD19(SB645)的，但是反过来，CD19是有漏到NK1.1的。请问这个问题该如何解决呢？调节补偿可以解决吗？还是必须换配色才行？

如果换的话，考虑是去掉B220，加一个CD45的marker，刚好标一下白细胞，之后会更好分析。把CD45放在Percp-cy5.5，CD19在PECY5，Nkp46在655，这样即使CD19和Nkp46漏到CD45，因为本来它们也是CD45阳性的，对统计来说影响会小一点。不知道我这样考虑对不对？

图7（CD19-SB645FMO在CD19所在通道上）

图8（NK1.1-PerCP-cy5.5FMO在CD19所在通道上）

图9（CD19-SB645FMO在NK1.1所在通道上）

图10（NK1.1-PerCP-cy5.5FMO在NK1.1所在通道上）

4、CD25阳性比例低（左），甚至比未染色的阴性对照（右）还低。两图都是取的活细胞看的。不知道圈阳性门时是否应该按照未染色对照的阴性群来圈？（我的经验是染了色的阴性群往往比未染色的阴性群要高一些，所以如果这种情况下分群明显，就不会完全按照未染色的阴性来圈门；但是这里感觉未染色组的阳性很高，就不知道怎么圈了……）是不是补偿调节得不够好的原因呢？还是因为阴性群有自发荧光呢？

图11（样品CD25-CD127表达）

图12（未染色组CD25-CD127表达）