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用磁珠分选法从PBMCs中成功分选出NK细胞,且纯度达到97%

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 楼主| 发表于 2021-2-2 17:08:27 | 显示全部楼层 |阅读模式

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面对一个未曾做过的实验项目——磁珠分选,我一开始读英文说明书都是小心翼翼的。后面经过反复尝试和练习后,终于掌握NK细胞磁珠分选技术,分选纯度从一开始的69.3%提高到了97.4%。
现在将相关说明书和实验中的注意事项记录并分享一下。
我买的是NK细胞阴选试剂盒。
实验前要根据自己每次操作的样本量,估算好自己将要操作的细胞总量,买好对应的分离柱(有大,中,小之分)。
1.磁珠分选过程尽量在冰上操作,过柱子后也在冰上收集细胞,我的指导老师说这样可以降低细胞死亡率和非特异染色。
2.可以适当延长磁珠孵育时间,比如45mins或1h。
3.孵育过程中,稍微轻弹,使磁珠充分结合,不要用力弹。
4.为避免分离柱频繁发生堵塞情况,将磁珠孵育好之后的混合物用磁珠分选Buffer稀释至更大体积(10倍都可以)。
5.收集到的细胞要反复过柱子,增加分选纯度,必要时最后一次用一个新的分离柱。


  



这是我第一次分选时的情形

这是我第一次分选时的情形

这是我后面有了冰上操作的意识后操作的情形

这是我后面有了冰上操作的意识后操作的情形

NK磁珠分选英文说明书.pdf

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磁珠分选缓冲液英文说明书.pdf

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20210130 NK sorting-Layout.pdf

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发表于 2021-2-2 20:51:50 | 显示全部楼层
感谢分享,加分鼓励 。

这个试剂盒,一个TEST的成本大概多少钱?
 楼主| 发表于 2021-2-2 23:25:24 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-2-2 20:51
感谢分享,加分鼓励 。

这个试剂盒,一个TEST的成本大概多少钱?

NK阴选试剂盒折后是7480元,里面只有两个试剂。一个是1 mL的 NK Cell Biotin-Antibody Cocktail,另一个是2 mL的 NK Cell MicroBead Cocktail, human。
至于每次的成本的话,根据自己每次实验用量,如果细胞总量大的话,用的试剂量也大。
实验成本还包括那个磁力架,磁力架很贵要一两万。我用的这种最小容量的吸附柱,一个要200块钱。
发表于 2021-2-3 09:19:01 | 显示全部楼层
Lydia 发表于 2021-2-2 23:25
NK阴选试剂盒折后是7480元,里面只有两个试剂。一个是1 mL的 NK Cell Biotin-Antibody Cocktail,另一个 ...

哦。
吸附柱可以重复用的吧?
另外,按照你的用法,毛估估这个试剂盒用了几次?
 楼主| 发表于 2021-2-3 13:36:10 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-2-3 09:19
哦。
吸附柱可以重复用的吧?
另外,按照你的用法,毛估估这个试剂盒用了几次? ...

吸附柱厂商说不建议重复使用,我之前也想过重复使用(想使用完后清洗干净并且高压一下下次用)。但是吸附柱里面很容易生锈,而且反复使用就不能保证完全洁净了。所以我没有重复使用过。
我试过堵了的柱子想清洗干净,然后在一次实验中继续用,最后还是不行,因为再通不了,可能我再通的方法不对。
我这个试剂盒以我每次的用量,能用十六七次。因为我每次是从30ml外周血里提取PBMCs,对应大约是3-6*10的7次方的PBMCs, 每次试剂用量是说明书里对应的6倍(说明书的剂量对应的是1*10的7次方个PBMC的总量)。

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发表于 2021-2-3 14:12:53 | 显示全部楼层
Lydia 发表于 2021-2-3 13:36
吸附柱厂商说不建议重复使用,我之前也想过重复使用(想使用完后清洗干净并且高压一下下次用)。但是吸附 ...

十分感谢你如此详细的回复
 楼主| 发表于 2021-2-3 22:26:30 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-2-3 14:12
十分感谢你如此详细的回复

感谢您提供这么好的平台,辛苦您这么多年的工作。
发表于 2021-2-4 09:46:04 | 显示全部楼层
本帖最后由 clz281 于 2021-2-4 10:08 编辑

特别感谢楼主的分享!我这边最近也在找这方面的产品,也找过这家供应商,对方给我配置的是CD56 MicroBesds,human磁珠。这种方式也是需要先密度梯度离心分离出PBMC。



DS_CD56 MicroBeads_human.pdf

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发表于 2021-2-5 17:01:37 | 显示全部楼层
老师,Miltenyi的产品货期一般都比较长,您这款产品的有效期是多久的?
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