小鼠B16-F10黑色素瘤模型肿瘤浸润免疫细胞分析

荷兰西瓜

第一次做小鼠B16-F10黑色素瘤模型，分析的是肿瘤组织中的免疫细胞，染的marker分别是：SV260-PE-Texas Red、CD45-APC-Cy7、CD11b-PerCP、F4/80-FITC、CD206-PE、Gr1-APC。实验遇到的问题总结如下：
1.死细胞特别多。预实验用的胶原酶消化肿瘤组织，当时分析出来也是死细胞特别多，后面正式实验改用在滤网上直接进行研磨过滤，但死细胞还是很多。不明白为什么死细胞会这么多？
2.免疫细胞很少。我查的一些资料里说黑色素瘤的固有免疫细胞浸润率很高，但我自己做出来的免疫细胞就特别少，很奇怪不知道为什么，是补偿没调对吗。不知道有没有前辈做过这个模型，能否分享一下经验啊
3.还有一个很基础的问题，就是如何通过FSC和SSC来初步排除细胞碎片和粘连细胞呢？我知道细胞碎片的FSC和SSC值都很小，但是这个”小“是个很模糊的概念啊，具体小到什么范围以内就可以把它看作是细胞碎片呢？同样排除粘连细胞能通过界定具体的范围进行排除吗？
希望大家帮忙分析分析~

niwanmao

你这几个图，是用酶消化的还是研磨的？
免疫细胞，主要靠CD45圈出来，你这里看上去比例低，应该主要还是受到碎片的影响，可能是碎片和细胞分不开。一般在性能稍微好一点的机器上，应该是分得开的。
FSC和SSC小到什么程度算碎片，这个不同机器不一样，要做很简单，就是上一管小鼠血细胞，了解其淋巴细胞所在位置，定下来之后，就上组织样本，就可通过淋巴细胞以左排除碎片。

荷兰西瓜

niwanmao 发表于 2021-2-2 20:50
你这几个图，是用酶消化的还是研磨的？
免疫细胞，主要靠CD45圈出来，你这里看上去比例低，应该主要还是受 ...

两个图都是研磨的
还有一个问题是关于画门的，图是别人帮忙画的，为什么图上圈的CD45-APC-Cy7要把SV260-PE-Texas red的一部分阳性细胞圈进去？不太明白为什么要把一部分死细胞圈进去？而且APC-Cy7和PE-Texas red激发光不一样(前者是640，后者是488)，发射光谱也没有重叠，想请教一下老师，图上这样圈的CD45是正确的吗？

niwanmao

荷兰西瓜 发表于 2021-2-3 10:32
两个图都是研磨的
还有一个问题是关于画门的，图是别人帮忙画的，为什么图上圈的CD45-APC-Cy7要把SV260-P ...

这样圈也可以。
也可以用CD45/FSC图来排除“非造血细胞”。

荷兰西瓜

niwanmao 发表于 2021-2-3 21:14
这样圈也可以。
也可以用CD45/FSC图来排除“非造血细胞”。

SV260不是标记死细胞的吗，为什么要把死细胞圈进去呢？

niwanmao

荷兰西瓜 发表于 2021-2-4 10:48
SV260不是标记死细胞的吗，为什么要把死细胞圈进去呢？

SV260不是你们的检测靶标？这个区分死活的染料我从没听说过

荷兰西瓜

niwanmao 发表于 2021-2-4 12:45
SV260不是你们的检测靶标？这个区分死活的染料我从没听说过

我们染的死活染料是Biolegend的fixable viability dye，是PE-Texas red通道，我问了一下组上的师兄为什么要把这个死活染料写成SV260，他也没说个所以然，我也有点懵。所以这样圈的CD45门是正确的吗？他为啥要把死细胞给圈进去啊？不明白他的圈门逻辑

niwanmao

荷兰西瓜 发表于 2021-2-5 12:28
我们染的死活染料是Biolegend的fixable viability dye，是PE-Texas red通道，我问了一下组上的师兄为什么 ...

那么是FVD染料。
那得把阳性的死细胞去掉。

yyV123

请问B16小鼠肿瘤组织一般上机要跑多少细胞呢，我最近做CD3，CD8,发现阳性的特别少，不知道是否需要增加细胞数呢

niwanmao

yyV123 发表于 2021-11-22 11:55
请问B16小鼠肿瘤组织一般上机要跑多少细胞呢，我最近做CD3，CD8,发现阳性的特别少，不知道是否需要增加细胞 ...

跟什么样本无关，关键是淋巴细胞要获取到足够细胞。
对于CD3和CD8这些表达量高的，淋巴细胞门内的有效信号至少要获取到5000~10000以上。注意，不是总细胞数，而是淋巴细胞门内。