CFSE检测T细胞增殖

Smile14 · 发表于 2021-2-5 16:30:57

本帖最后由 Smile14 于 2021-2-5 16:48 编辑

我做的课题是与BiTE相关的，想做在抗原和BiTE存在下，促进T细胞增殖，但做了几次都没做出来差异
1.原先T细胞是PBMC来源，做了OKT3诱导，IL2+KBM581培养，培养很长时间后，与肿瘤细胞共培养（DMEM+FBS，未额外加IL-2)做的CFSE增殖发现3天基本峰与父代对比不移动；
2.后来，尝试使用刚分离的PBMCs直接与肿瘤细胞培养（未加IL-2），5天也没有移动；
3.最后，我们用了新分的PBMCs与肿瘤细胞培养（加IL-2），5天也没有移动。
4.染色条件：参照的Protocol文章

cfse protocal 翻译.pdf (474.81 KB, 下载次数: 53) ，PBMCs细胞1x10 7，用1mL PBS（含5% FBS），室温染色5min，5倍体积PBS（含5% FBS）洗两次，隔天上流式做的父代峰（CD45-APC用于标记PBMCs细胞，由于实验室的CD3-APC用完了所以用的CD45;后期要做CD4/CD8-PE染色所以没有用PI染料区分活死细胞）
5.下图是最新的一次（第3点）实验结果，左侧：24h纯PBMCs的CD45分群；中间：6天后肿瘤细胞+PBMCs+BiTE的CD45分群；右侧：红色为左测组的CFSE峰，蓝色为中间组的CFSE峰。（CD45能大部分代表T的群，刚分完PBMC测了淋巴细胞分群情况CD3占了80%以上附图）6.请教大家如何优化实验来达到需要的结果：是否是CFSE有效浓度降低，染色时候FBS影响染色等？
谢谢大家

CFSE

niwanmao · 发表于 2021-2-6 22:05:22

浓度上面看起来问题不大，是不是时间不够长？

Smile14 · 发表于 2021-2-7 11:05:12

niwanmao 发表于 2021-2-6 22:05
浓度上面看起来问题不大，是不是时间不够长？

但这个我CFSE的电压是调比较高的，平时FL1的电压我们基本在250左右，这次调到了350左右；下次我试一下把染色时间提高或者拿一支新的CFSE染料依据站里分享的染色方法再做一次。

tiger · 发表于 2021-2-7 12:18:45

Smile14 发表于 2021-2-7 11:05
但这个我CFSE的电压是调比较高的，平时FL1的电压我们基本在250左右，这次调到了350左右；下次我试一下把 ...

不是CFSE染色的问题，从细胞形态来看，T细胞没有增殖。应该用CD3、CD28、IL2增殖培养体系，且CD3一定要包被。

Smile14 · 发表于 2021-2-7 16:37:40

tiger 发表于 2021-2-7 12:18
不是CFSE染色的问题，从细胞形态来看，T细胞没有增殖。应该用CD3、CD28、IL2增殖培养体系，且CD3一定要包 ...

老师您好，我这是做的双特异性抗体的，一侧靶向肿瘤TAA，一侧靶向CD3，本来想检测双特异性抗体促进T细胞增殖的，那下次我先做一个CD3/CD28 beads的阳参组吗？还是用ConA

开心小松鼠 · 发表于 2021-2-19 16:37:20

您好我近期也再做CFSE染色淋巴细胞增殖实验，您用的什么软件分析的？

niwanmao · 发表于 2021-2-21 09:16:20

开心小松鼠发表于 2021-2-19 16:37
您好我近期也再做CFSE染色淋巴细胞增殖实验，您用的什么软件分析的？

一般最常用的是Modfit软件。

开心小松鼠 · 发表于 2021-3-3 10:03:07

niwanmao 发表于 2021-2-21 09:16
一般最常用的是Modfit软件。

倪老师您好，能分享一篇关于modfit软件分析淋巴细胞增殖的文章吗？谢谢

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