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[其它] 小鼠外周血中性粒细胞流式检测

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 楼主| 发表于 2021-2-16 19:50:23 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星

                               
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以上是中性粒细胞裂红后的流式细胞图,R4是CD45+CD11b+Gr-1hi的中性粒细胞。
1.小鼠眼眶取血,由于实验室没有肝素抗凝,我采用的是EDTA抗凝,不知是否会对流式分析产生影响?
2.FSC-SSC中,红色圈出的P1门是否能完全代表活细胞?是否应该把左下角的那一群细胞也圈出来?
3.采用anti-Ly6G抗体去耗竭中性粒细胞后,为何48后,虽然R4门中性粒细胞比例确实下降了,为何R5的比例会增加那么多?
以上是我的一些问题,忘各位老师不吝赐教,谢谢!

圈出活细胞

圈出活细胞

FL2通道是CD45+细胞

FL2通道是CD45+细胞

FL1通道是CD1b+,FL4通道是Gr-1 +细胞

FL1通道是CD1b+,FL4通道是Gr-1 +细胞

中性粒细胞耗竭48后的细胞比例变化

中性粒细胞耗竭48后的细胞比例变化
发表于 2021-2-17 12:01:27 | 显示全部楼层
在回答之前,先提一个建议,以后做流式图,请尽量将坐标名称都标记为抗体名称,方便他人理解。

1、EDTA抗凝,一般不会有影响。
2、P1门可代表活细胞,左侧是碎片。
3、Ly6G耗竭后,R5内的细胞,应该仍然是粒细胞,只不过发生了Gr-1的下调。我不知道你的实验步骤是什么样的,是在体内耗竭还是体外?
 楼主| 发表于 2021-2-18 10:12:56 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-2-17 12:01
在回答之前,先提一个建议,以后做流式图,请尽量将坐标名称都标记为抗体名称,方便他人理解。

1、EDTA抗 ...

倪老师你好,这是我的实验步骤,请倪老师帮我看一下,望老师能批评指正,提出宝贵建议!
1. 首先给荷4T1肿瘤的小鼠腹腔注射anti-Ly6G抗体 250微克 耗竭中性粒细胞
2.分别在耗竭中性粒细胞前、耗竭中性粒细胞24h,48h眼眶采血100微升静脉血,EDTA抗凝
3.索莱宝的红细胞裂解液裂解两次,分别裂解15min和5min
4.CD45-PE、CD11b-FITC、Gr-1-APC抗体,4度孵育30min
5.PBS清洗两遍上流式

我想再请教倪老师:
1.CD16/32非特异性抗体封闭是不是必须的?
2.如果中性粒细胞耗竭之后,部分中性粒细胞的Gr-1biaoda1下调,那我是否需要引入另外一个Maker,比如F4/80或者Ly6C来判断中性粒细胞实际的耗竭效果?请问引入哪一个maker会更好一些呢?我采用的流式仪器是BD-C6
感谢老师,期待你的回复!
发表于 2021-2-18 12:37:04 | 显示全部楼层
菜根谭 发表于 2021-2-18 10:12
倪老师你好,这是我的实验步骤,请倪老师帮我看一下,望老师能批评指正,提出宝贵建议!
1. 首先给荷4T1 ...

1、阻断还是建议尽量做上去,尤其是粒细胞和单核细胞染色时。
2、下调,其实目前的标记也够了,你可以对比耗竭前后的图,淋巴细胞的Gr-1水平,耗竭后也出现明显降低,这说明了什么?说明耗竭前的非特异性染色比较明显,所以我的建议是先将染色做好吧。但从目前的比例来看,似乎有一定效果,但不是很明显。
 楼主| 发表于 2021-2-18 13:44:44 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-2-18 12:37
1、阻断还是建议尽量做上去,尤其是粒细胞和单核细胞染色时。
2、下调,其实目前的标记也够了,你可以对 ...

好的,谢谢老师,请问上述中性粒细胞耗竭之后Gr-1表达下调是与我的流式非特异性染色有关是吗?除了增加CD16/32的阻断,我还可以进行哪些条件优化呢?
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