BMDM在培养条件下呈iNOS+Arginase+双阳性？

Fzw

大家好，我是免疫学小白，刚开始在巨噬细胞方面的研究，有一个问题想请教大家。

我提取了小鼠C57BL/6骨髓来源的巨噬细胞 (BMDM)，CSF-1分化7天之后尝试包裹到水凝胶里面，在DMEM+10%HI-FBS条件下培养三天，想看看在不同的水凝胶环境下是否会对BMDM的表型产生改变。

我选取了iNOS-PE和Arginase-1-APC分别作为M1和M2的marker，染色跑流式，期间用CD16/CD32去block Fc受体，理应没有非特异性染色，流式结果粘贴如下。

仿佛看到水凝胶实验组1-4都有一些population在iNOS+Arginase-1+双阳性的区域，尤其是实验组1感觉很大population偏移到双阳性区域，想问这是否正常？或者是因为我的人为影响有什么artifact在后面？

尝试去找过一些参考文献，没有找到很多把inos和arginase放一起的流式图应该是什么样子，找到一篇粘贴如下，不过想知道这种gate的方式常见吗？谢谢大家！

niwanmao

其它你也应该像文献那样，设斜向的门，如下图：



另外提醒一下，下次上传图片，不要直接复制进编辑框，否则一大堆base64编码，导致图片显示不出来（你的帖子我编辑过了，将BASE64转换为了真正的图片，所以现在才正常了）。下次用编辑器工具栏上的“图片”按钮：

Fzw

niwanmao 发表于 2021-2-27 08:25
其它你也应该像文献那样，设斜向的门，如下图：

好的，谢谢倪老师！第一次发帖不够熟悉，下次会注意。

想问老师斜向画门的原因是什么？算是常见的画门方法吗？另外想系统学习一下画门的方法，站里有相关的资源吗，谢谢老师！

niwanmao

Fzw 发表于 2021-2-28 06:28
好的，谢谢倪老师！第一次发帖不够熟悉，下次会注意。

想问老师斜向画门的原因是什么？算是常见的画门方 ...

我们希望最理想的门，就是横平竖直，但现实总是无法如人意，两个通道之间的荧光渗漏，无法完全扣除，形成扩散误差，所以需要用斜向门来弥补。

Fzw

niwanmao 发表于 2021-2-28 14:00
我们希望最理想的门，就是横平竖直，但现实总是无法如人意，两个通道之间的荧光渗漏，无法完全扣除，形成 ...

好的谢谢老师！想问下荧光渗漏问题不会被补偿调节解决吗，我当时用了Near-IR (活死染料)，iNOS-PE, Arg1-APC三管分别单染，BD软件自动算出补偿值，现在的是处理之后的图片。

另外想问为什么这种问题好像在实验组1-2更为严重？实验组3-4稍微好一点，如果是染料之间的渗漏是否应该所有组都会存在？谢谢老师！

niwanmao

Fzw 发表于 2021-3-1 00:04
好的谢谢老师！想问下荧光渗漏问题不会被补偿调节解决吗，我当时用了Near-IR (活死染料)，iNOS-PE, Arg1- ...

这三个通道，理应不存在荧光渗漏，但是培养后的细胞，尤其巨噬，非特异性结合本身就强，于是就形成了这样的一个分布。
至于4管之间的差异，可能跟细胞所处的状态有关。

Fzw

niwanmao 发表于 2021-3-1 09:28
这三个通道，理应不存在荧光渗漏，但是培养后的细胞，尤其巨噬，非特异性结合本身就强，于是就形成了这样 ...

好的，谢谢倪老师！