流式补偿值的大小

shaojun

各位前辈：
    我最近刚接触流式，会基本的操作。但是对于原理性的一些东西没有什么概念。比如荧光补偿值的大小对试验结果有什么影响？在最近的几次试验中，我要从脐带血分选一些造血干细胞，用到了FITC, PE, APC, Percp/Cy5.5, PE/Cy7, BV605, BV510这组抗体。每次试验都做了单染，单染也挺好。染色完毕之后，我先上单染，用的是BD Fortessa 仪器。看阴性峰和阳性峰能否分开，是否跑出横坐标。当确定二者能分开，且阳性峰在10^3~10^4之间，就用仪器自动算补偿值。然后上样检测。
    在实验过程中，我注意了一下，BV605的电压值是404，PE的电压是524，Percp/Cy5.5电压为615，PE/Cy7电压为606。自动计算补偿值PE-BV606为48.15，Percp/Cy5.5-BV605为20.54，PE/Cy7-BV605为13.19。
后来我把BV605的电压调到了350,其余不变，结果自动计算补偿值PE-BV606为157，Percp/Cy5.5-BV605为60，PE/Cy7-BV605为44;
我又再次把电压调到了BV605的电压调到了430，其余不变，自动计算补偿值：PE-BV606为33，Percp/Cy5.5-BV605为12.45，PE/Cy7-BV605为9.38。
    问题是：这些条件都可用来检测，但是不同的条件，会对检测结果产生很大的影响吗？补偿值在什么范围内合适？补偿值过大对结果又有什么影响呢？
还望各位前辈赐教。谢谢！

niwanmao

严格的说，调补偿应该叫调节SOV值（荧光渗漏），所以会出现100以上的数字。只要是按规则调节，没有硬性规定范围。

但是，同一种荧光素，阳性群和阴性群（即信噪比）分得越好，SOV值的调节会越准确。所以，建议先确定好最佳的信噪比（包括确定抗体用量、电压）之后，再调补偿，此后电压便不允许再调动。

shaojun

niwanmao 发表于 2021-3-9 08:13
严格的说，调补偿应该叫调节SOV值（荧光渗漏），所以会出现100以上的数字。只要是按规则调节，没有硬性规定 ...

老师，我是不是可以理解为：只要单染的阳性群和阴性群能明显的分开，采用仪器自动调补偿或者手动调补偿。电压不变，那么补偿值的大小对于实验结果基本上没有影响，对吧？

niwanmao

shaojun 发表于 2021-3-9 12:57
老师，我是不是可以理解为：只要单染的阳性群和阴性群能明显的分开，采用仪器自动调补偿或者手动调补偿。 ...

1、确定最佳信噪比之后，用最佳电压和最佳抗体用量，手动调补偿或自动调补偿。
2、以后的实验样本，电压保持不变，那么SOV值基本不变。

shaojun

niwanmao 发表于 2021-3-9 19:44
1、确定最佳信噪比之后，用最佳电压和最佳抗体用量，手动调补偿或自动调补偿。
2、以后的实验样本，电压 ...

明白了，谢谢您！

shaojun

    这两天又集中做了几次流式，发现虽然在一定的电压范围内，都能比较好的将单染的阳性群和阴性群区分开。但是，上机检测样品时，最好让仪器自动计算补偿值，做到心里有数。
    回头用Flowjo进行样品分析会发现，当各荧光之间的补偿值比较大时，基本不能依赖flowjo自动计算补偿，而且手动调节补偿的时候也很不好调，自然流式图也很难看；如果上机检测时自动计算的补偿值小，那么分析时，基本能相信flowjo计算的补偿，流式图也会比较好看。
    具体的经验就是，在同一台仪器上，尽量记住各单染的电压值，这样就不用每次上样都要调单染的电压和补偿值了；但是如果更换了其中某一种抗体，或者增加了一种或几种抗体，那么电压都需要从新调整，采用手动调补偿的方式，选择合适的电压，再进行收样，而不是直接收单染回头分析的时候再去看，这个时候由于电压值已经确定，已无法人为将补偿值调小了。
    简单来说，补偿值小一些比较好！！！
    大家仔细观察flowjo计算补偿后数值的颜色，值越小，颜色越浅；当补偿值为50的时候，颜色就明显加深了，补偿值到200就变成红色。所以个人感觉，补偿值尽量控制在50以下比较稳妥！
纯属个人体会，欢迎交流讨论。