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[细胞增殖] CFSE测细胞增殖结果分析

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发表于 2021-3-17 11:11:07 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏2流星未解决
各位老师好,我近期做了CFSE检测细胞增殖预实验,但是结果无法分析。想请问下是什么原因
实验方案:新鲜外周血PBMC,加入anti-CD3/cd28各1ug/ml,CFSE终浓度2uM。培养4天。
CFSE单染组:
CFSE染色+刺激剂组

需要请教下,两个图没啥区别觉得。然后每个图上小的峰怎么解释呢。
谢谢

仅加CFSE单染组

仅加CFSE单染组

CFSE+刺激剂组

CFSE+刺激剂组
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
发表于 2021-3-17 12:17:46 | 显示全部楼层
FSC/SSC散点图分群如何?
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发表于 2021-3-19 12:03:19 来自手机 | 显示全部楼层
分析CFSE荧光强度前,应该要圈定淋巴细胞群,你是不是把碎片圈进去了。
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 楼主| 发表于 2021-3-22 08:43:45 | 显示全部楼层
非常感谢以上老师们的回复。暂时手头没有flowjo,稍后把FSC/SSC散点图附上。
以下是新的结果,我整理了下问题。
1、阴性对照组和实验组比较,横坐标10^3-10^4次方之间都仍存在一个峰,这个峰是怎么回事?(如同我最初问的那样,是我圈门时圈进去的随便?稍后我附上圈门图)
2、我的实验组,0峰(未增殖峰)远高于增殖的峰,解释?增殖的缓慢,或者培养时间还不够?(实际上我的条件是antiCD3/cd28刺激PBMC4天的,我觉得这个时间够了,或许是anti-CD3/cd28仅主要特异性刺激T细胞)
3、实验组和对照组比起来,增殖的峰确实高了一些,但是这个图仍不理想,求建议

4d对照组

4d对照组

4d实验组

4d实验组

合并

合并
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发表于 2021-3-22 09:42:21 | 显示全部楼层
看FSC/SSC散点图分群如何,要先把死细胞和碎片都排除掉,0号峰高说明未发生增殖的细胞数量多,这个可以在收样上机前先在显微镜下看看细胞的增殖状态,数量,大小,折光性,对增殖活力先有个初步的判断,才好分析流式的原因。一般发生增殖后的淋巴细胞体积会变更大,圆,亮,折光性好,活力高时还会有集落。
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 楼主| 发表于 2021-3-22 09:50:45 | 显示全部楼层
samly0 发表于 2021-3-22 09:42
看FSC/SSC散点图分群如何,要先把死细胞和碎片都排除掉,0号峰高说明未发生增殖的细胞数量多,这个可以在收 ...

感谢您的指导。。稍后我确认下我的散点图,但是上机没有染死活,之前染过一次7-AAD,不知道为什么流式图不大对,可能是电压通道没调好。。细胞增殖培养期间和上机前,镜下可以看到克隆团,孔的中心肉眼可以看到白色点状聚集。但具体单个细胞的折光性等我不确定(不会看)。我理解0号峰高——未增殖细胞数量多,考虑我培养时间已达4天,我觉得可能与我用CD3/CD28刺激PBMC有关,或许是刺激剂非特异,要是刺激T细胞或许更好。
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发表于 2021-3-22 10:02:51 | 显示全部楼层
显微镜下可以将视野移到克隆团附近,找单个细胞看,调到最高倍镜下观察单个细胞,跟未刺激组对比,整体是不是都增大了。细胞膜光滑完整的细胞,折光性好亮度会比较高,死细胞胞膜不完整,亮度低
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发表于 2023-1-16 12:11:57 | 显示全部楼层
samly0 发表于 2021-3-22 09:42
看FSC/SSC散点图分群如何,要先把死细胞和碎片都排除掉,0号峰高说明未发生增殖的细胞数量多,这个可以在收 ...

你好,请问为什么要先排除死细胞呢,死细胞多数是0代细胞,排除死细胞的话增殖比例更高,这样的话数据还准确吗。
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