BD CBA Flex ES kit 实验用错稀释液失误影响？

applebernie · 发表于 2021-3-22 19:43:42

各位老师好，本人近期在做BD CBA Flex ES human cytokine实验时，在稀释微球的时候误用了Assay Diluent而不是Beads Diluent, 在快加完beads后才发现这个问题，当时瞬间慌了，为了补救实验，遂在已经混合在Assay Diluent里的微球里加了等量的Beads Diluent,充分混合后再加入96孔板中。这样算来平均一个孔就多了4.5uL的Assay Diluent，第一步结束最终体积由35uL变成了39.5uL. 其他实验条件以及加的试剂量不变。个人想当然觉得我这个失误对于这种抗体抗原反应基础的实验应该影响不算太大，毕竟总的蛋白量和微球数量都没有变少，只是被稍微多稀释了一点，可能会对微球和蛋白的binding效率有点影响。但其实质有什么影响我也数不清楚，毕竟Beads Diluent也被稀释了，我也不清楚这个微球稀释液具体特性是什么。最后上机跑了之后所有微球群体均被检出，各因子标准曲线拟合也都很好，板子里放的实验室一直用的control（培养液上清1/200稀释，实验样本都是人血清）里各细胞因子的表达量也和别人跑的结果相差不大。实验室博后看了觉得没啥问题，但我心里还是吃不大准，所以想向懂行的老师请教这么做具体会有什么影响？在此先谢谢了！

niwanmao · 发表于 2021-3-22 20:12:45

实践证明无差异，那就是好的。
Diluent不同种之间，可能有些许差异，但在这个试剂盒里面的，肯定在成份上肯定都是无影响的，其次这里的问题主要是终体积增大了10％，那么最后的浓度可能略降低，但不会成比例出现明显降低，所以你在最终结果上会感觉不到很明显的异常。

applebernie · 发表于 2021-3-22 20:31:14

niwanmao 发表于 2021-3-22 20:12
实践证明无差异，那就是好的。
Diluent不同种之间，可能有些许差异，但在这个试剂盒里面的，肯定在成份上肯 ...

谢谢倪老师。我主要吃不准的还有一个原因就是结果和我们项目的预期不符。我们的样本是儿童血清（实验组预期有轻微炎症），这次一共用了CBA ES Flex全部的11个kits。我一个导师（主要生理那边）那边预期TNF，IL-2, IL-6，IFN-r实验组表达会比对照组更高。但我的结果显示在绝大多数样本中这些细胞因子的含量都低于可被测量范围，拟合后显示为0。对此我们实验室（主要是做免疫病理诊断）觉得结果还算合理，因为就我们手机的Normal Range（刚开始做，目前大概二十几个样本，都是成年人）来开看，除了IL-6能被测出的人数偏少，其他几个因子表现还算正常，很多人的数据软件拟合后显示也是0（此处又有疑惑，毕竟看到倪老师之前贴过的normal range还都是有数据的），因此才对结果不太自信。流式用的是BD Canto一代，实验前均跑了CST和进行了针对CBA的校准，分析软件用的BD FCAP Array V3. 另外还有个问题就是软件中显示的各个微球的位置没有说明书上的那么整齐，具体我明天截图了再上传给您看看。

applebernie · 发表于 2021-3-22 20:35:17

niwanmao 发表于 2021-3-22 20:12
实践证明无差异，那就是好的。
Diluent不同种之间，可能有些许差异，但在这个试剂盒里面的，肯定在成份上肯 ...

补充一下继续，我们全部大概80多个样本，TNF, IL-6, IFN之类热门pro-inflammatory cytokine能被检出数值的样本都很少。大部分样本却都能被检出IL-10和IL-8表达。具体数据相关性还没分析，只是生理那边导师似乎不太满意。

niwanmao · 发表于 2021-3-23 07:44:59

applebernie 发表于 2021-3-22 20:35
补充一下继续，我们全部大概80多个样本，TNF, IL-6, IFN之类热门pro-inflammatory cytokine能被检出数值 ...

FCAP会把低于他们检测限的数值全部归为0。
虽然你们觉得合理，但对于发文章，确实是很尴尬的。
所以建议自行进行4次多元参数回归分析，拟合出来后计算，就不会出现0的问题。
但无论如何，至少说明数据都是非常低的。

你们的标曲和实验样本的Excel文件如果方便的话，可传上来我看看。

applebernie · 发表于 2021-5-11 16:02:17

niwanmao 发表于 2021-3-23 07:44
FCAP会把低于他们检测限的数值全部归为0。
虽然你们觉得合理，但对于发文章，确实是很尴尬的。
所以建议 ...

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IL-6.zip (7.19 KB, 下载次数: 0)

谢谢倪老师的建议，不好意思现在才来回复，前阵子被别的事耽搁了。我这两天又看了下结果，并尝试用别的软件来拟合标准曲线来分析，发现以下问题：
1. 我的实验结果中，有几个细胞因子在没有标准品（浓度0）的孔中MFI似乎偏高，有的甚至高过了倒数第二个浓度（0.27pg/mL）的读值,这就导致了很多孔尽管有MFI读值，但是通过标准曲线（Quadradic, 5 Polynomial等方式拟合）计算出来的实际读值为负数。就算敲出了0点的数据，还是会给出负值，除非用线性拟合。
2. 接着问题1，这是不是说明我的实验操作出现了问题？但这种现象也不是每个细胞因子都出现了，当时beads用的排枪上样，而浓度0的孔应该是最先上样的孔，出现交叉污染可能性应该很小。另外请问出现了这样的状况还能不能补救数据？
3. 我做的两点重复，在某些样本中，MFI值接近，软件给出两点的平均值一个为0.40，其中点一数值为0.42，点二显示0，照理说第二个点浓度应该为0.38才对，难道还是curve fitting问题？
4.我上传了我的beads分布图，所有的标准曲线，以及我IL-6部分的数据，请倪老师帮忙看看。另外我的beads分布图没有说明书上的那么整齐，尤其是A7,A9,B8，请问倪老师这是因为什么造成的，又能通过什么方法避免呢？

再次谢谢倪老师了！

niwanmao · 发表于 2021-5-11 22:50:51

applebernie 发表于 2021-5-11 16:02
谢谢倪老师的建议，不好意思现在才来回复，前阵子被别的事耽搁了。我这两天又看了下结果，并尝 ...

如果0孔超出其它孔，只能说明操作问题。
建议重复标准曲线。
如果无法重复，只能取线性度最好的几个孔做标曲。

微球分布不整齐，可能跟你的仪器性能有关

applebernie · 发表于 2021-5-12 00:07:45

niwanmao 发表于 2021-5-11 22:50
如果0孔超出其它孔，只能说明操作问题。
建议重复标准曲线。
如果无法重复，只能取线性度最好的几个孔做 ...

谢谢倪老师，我看了下，在全部的11个检测的细胞因子中，ifn-r（主要其中一个点误差太大），IL-6的blank高于最低浓度，其他大多都是显示为0，少数几个有类似0.01pg/mL的读值。
标曲应该无法重复了，因为beads一次性都用完了。我看了下线性度基本还可以，可能要去掉某几个blank的点再来拟合。
我现在还有一个疑问，对于我这些样本，如果降低稀释因子从1/4到1/2，或者直接用未稀释的样本会不会更好？稀释血清这一步是不是必须做的？
我的理解是如果稀释因子降低，MFI会相对升高，原来拟合不出来的也许就能成功了。

谢谢！

niwanmao · 发表于 2021-5-12 07:42:37

applebernie 发表于 2021-5-12 00:07
谢谢倪老师，我看了下，在全部的11个检测的细胞因子中，ifn-r（主要其中一个点误差太大），IL-6的blank高 ...

降低稀释倍数，其实就相当于拟合浓度高的那几个点，跟舍弃低浓度的点意义一样。这是一个解决办法，不过对低浓度会有不良影响，因为一般在高浓度和低浓度位置，曲线分布会略有不同。

applebernie · 发表于 2021-5-12 12:52:35

niwanmao 发表于 2021-5-12 07:42
降低稀释倍数，其实就相当于拟合浓度高的那几个点，跟舍弃低浓度的点意义一样。这是一个解决办法，不过对 ...

谢谢倪老师的解惑！

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