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[流式protocol] 如何用流式来检测细胞焦亡?

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 楼主| 发表于 2021-3-25 16:13:24 | 显示全部楼层 |阅读模式

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细胞焦亡引起的细胞死亡关键取决于炎性半胱氨酸蛋白酶对gasdermin的裂解,然后gasdermin N端片段的寡聚化和膜易位。 目前,流式无法直接追踪这些事件,检测gasdermin D蛋白(GSDMD)的裂解,是细胞焦亡的唯一确定证据。 然而,一旦确认了细胞焦亡,就可以通过流式间接检测到细胞焦亡。

细胞死亡命名委员会将焦亡定义为「一种受调节的细胞死亡形式」,它主要取决于gasdermin蛋白家族成员质膜孔的形成,通常是(但并非总是)由于炎性半胱氨酸蛋白酶激活而引起的。细胞膜破裂和DAMPs释放是焦亡通常的特征,焦亡是对微生物感染的反应,在抵抗细胞内病原体的免疫中起着至关重要的作用。细胞焦亡会破坏受感染的细胞,从而引起细胞内病原体的释放,使其易于被中性粒细胞杀死和吞噬。 DAMPs和炎性细胞因子IL-1β和IL-18的同时释放会招募更多的免疫细胞,从而确保固有免疫系统和适应性免疫系统均具有强大的炎症反应。但是,焦亡还可以驱动致病性炎症,如死性败血性休克。焦亡通常在专业吞噬细胞中观察到,但在其他细胞类型中也可能发生。焦亡的诱因包括细菌和病毒及其产物,即LPS和病毒DNA。

步骤示例
下面的示例以胰腺癌细胞为例子,请大家根据自己做的细胞种类,进行条件调节和优化。

1. 在含10%v/v FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和50μg/mL链霉素和青霉素的1mL RPMI1640培养基中的12孔板中接种1x10E5 BxPC3胰腺腺癌细胞。 要分析的每种条件需重复三个孔。
2. 让细胞在含有5%v/v CO2的加湿培养箱中在37°C下生长24小时。
3. 用100μLDMSO重建Pyroptosis/Caspase-1分析试剂盒中包含的冻干尼日利亚菌素(Nigericin),配制成5mM储存液。 储存液可以避光并最多解冻两次,可以在–20°C下保存1年。
4. 在使用前,用无菌超纯水将尼日利亚菌素储存液稀释至工作浓度为500μM。
5. 从细胞中去除旧培养基。
6. 要启动细胞焦亡,在37°C下将细胞在300μL含有20μM 尼日利亚菌素的新鲜培养基中预孵育1 h(必须确定每种细胞的最佳浓度)。
7. 用50μLDMSO重建Pyroptosis/Caspase-1分析试剂盒中包含的冻干FLICA的小瓶,产生150–300x的储存液。 储存液可以避光并最多解冻两次,可以在–20°C下保存6个月。
8. 用无菌PBS将FLICA储存液以1:5稀释到30–60x工作液中,并立即将工作液添加到每种条件的两个孔中的细胞中,最终浓度为1-2x。
9. 避光保存,在37°C下孵育细胞48小时。
10. 用超纯水将Pyroptosis/Caspase-1分析试剂盒中包含的10倍细胞洗涤缓冲液稀释至1倍。
11. 将培养基和解离下的细胞一起转移到置于冰上的5 mL试管中。
12. 向每个孔中加入300μL1x细胞洗涤缓冲液,在37°C下孵育10分钟(这可使未结合的FLICA从细胞弥散出来,被洗涤掉)。 去除洗涤缓冲液,然后重复步骤11转移到5 mL试管中。
13. 重复第12步。
14. 向每个孔中添加300μL Accutase酶,在37°C下孵育10–15分钟,以解离所有剩余的贴壁细胞,并将所有液体(含解离后的细胞)转移到新的5 mL试管中。
15. 用300μL 1×细胞洗涤缓冲液洗涤每个孔,将所有液体参照步骤14转移到5 mL试管中。
16. 将步骤13和步骤15所得的5 mL离心管在4°C(5 min,400×g)下离心以收集所有细胞。
17. 弃去上清液,并用冷的1×细胞洗涤缓冲液 洗涤细胞两次。 小心避免细胞丢失。
18. 将来自步骤13和15的两个相应试管中的细胞重悬并合并到总共300μL冷的1×细胞洗涤缓冲液中,并置于冰上。
19. 对于单色分析或单色补偿对照(caspase-1活性),需在4小时内上机获取(用FLICA处理的第一个孔),或在16小时内通过添加Pyroptosis/Caspase-1检测试剂盒中的固定剂(v/v比为1:5)并将样品保存在4°C避光的地方。 对于双色分析(caspase-1活性和膜完整性的丧失),需在用FLICA处理的第二个孔中向细胞中添加2μg/mL PI,并立即上机获取,不能固定。 对于单色补偿控制(膜完整性丧失),需在第三个孔(未用FLICA处理)中的细胞,添加2μg/ mL PI并立即进行上机获取。
   

分析示例
(A)BxPC-3细胞用或未用尼日利亚菌素处理48 h的单参数分析,通过FAM-FLICA染色分析caspase-1活性(在之前的预实验中确定48 h为最佳时间点,可最佳分离FAM-FLICA阳性和FAM-FLICA阴性群体)。
2021-03-25_16-13-47.jpg


(B)BxPC-3胰腺腺癌细胞的FLICA和PI双参数分析,用或未用尼日利亚菌素刺激48 h诱导焦亡(细胞和刺激因素和图A一样)。对于每个样品(未处理和已处理的细胞)。
2021-03-25_16-13-58.jpg

还需要通过例如蛋白质印迹法等方法来验证细胞凋亡。


节选自:Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur. J. Immunol. 2019. 49: 1457–1973
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发表于 2021-3-26 11:03:40 | 显示全部楼层
想请问一下老师,FAM-FLICA是什么?激发光与发射光分别是多少呢?
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 楼主| 发表于 2021-3-26 13:10:02 | 显示全部楼层
Veblen 发表于 2021-3-26 11:03
想请问一下老师,FAM-FLICA是什么?激发光与发射光分别是多少呢?

FAM荧光素,激发和发射光与FITC相似。
FLICA全称是Fluorochrome Inhibitor of Caspases,是用来检测casepase活化的。
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