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[标本处理] 小鼠PBMC,Treg/Th17流式求助

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 楼主| 发表于 2021-3-31 15:04:54 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
[img]blob:https://www.flowcyto.cn/2bd4c410-bd32-430b-a813-0fc6979a3b44[/img][img]blob:https://www.flowcyto.cn/7e4f22ae-a90f-4614-afb2-1900a15cbac5[/img]

如图。用APC标记的Foxp3,用PerCP-Cy5.5标记的IL-17A。两张图均先画了CD4阳性门。
左边那张图没有经过Cell stimulation kit刺激,Foxp3的分群很清楚。而右边图片则是为了染IL-17A而将细胞进行刺激,条件是37℃下4小时。Foxp3的分群就差了很多。两个样本除了Cell stimulation kit刺激之外,其他条件完全一致。
我知道用PMA等刺激之后CD4的表达水平会下调,但对于Foxp3来说,效果也是如此吗,还是我的结果存在问题呢?麻烦老师解答,谢谢老师!

 楼主| 发表于 2021-3-31 15:08:28 | 显示全部楼层
本帖最后由 Ocean 于 2021-3-31 15:09 编辑

图片好像挂了,重新上传一下。

刺激

刺激
未刺激.png
发表于 2021-4-1 08:22:05 | 显示全部楼层
Ocean 发表于 2021-3-31 15:08
图片好像挂了,重新上传一下。

不知道是否重复多次均是如此?
刺激之后,往往需要充分将培养基洗涤干净再进行染色,同时,建议有必要加上CD25,利用CD25和foxP3,有时候即使foxP3荧光强度弱一点下来了,也相对容易分群一些。
发表于 2021-4-1 15:04:05 | 显示全部楼层
Cell stimulation kit里面是什么成分,会不会因为这个试剂是诱导T细胞分化成Th17的,所以Treg就少了?
 楼主| 发表于 2021-4-1 15:35:45 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-4-1 08:22
不知道是否重复多次均是如此?
刺激之后,往往需要充分将培养基洗涤干净再进行染色,同时,建议有必要加 ...

是的,重复了很多样本,刺激过的样本很明显Foxp3分群差很多。使用的Cell stimulation kit是eBioscience™ Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X),货号00-4975-93。我们在刺激完以后洗涤了两遍。
我们之前单做Treg的时候是染CD25的,这里因为想做Th17/Treg平衡,参考了几篇高分文献的做法,就没有加CD25了。我想我们之后可以再加染上CD25,谢谢老师的回复~
 楼主| 发表于 2021-4-1 15:37:42 | 显示全部楼层
samly0 发表于 2021-4-1 15:04
Cell stimulation kit里面是什么成分,会不会因为这个试剂是诱导T细胞分化成Th17的,所以Treg就少了? ...

使用的是eBioscience™ Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X),是佛波醇酯 12-十四酸酯 13-乙酸酯 (PMA)、离子霉素、Brefeldin A 和莫能菌素的混合物。
发表于 2021-4-7 09:49:20 | 显示全部楼层
eBioscience™ Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X)这个是为了检测IL-17A这种胞内细胞因子用的,检测Foxp3不需要加。IL-17A是胞内因子,Foxp3是核内因子,我之前标记过Foxp3要用专用的胞核固定破膜剂的,会不会是因为在同一管样本里同时检测胞内和核内因子,影响核内因子的染色?要不分开染试试?
发表于 4 天前 | 显示全部楼层
我做的也是Treg/Th17的平衡,我是分开染的。能加个联系方式交流一下吗。
发表于 4 天前 | 显示全部楼层
pityham 发表于 2021-4-14 18:37
我做的也是Treg/Th17的平衡,我是分开染的。能加个联系方式交流一下吗。

这里直接交流不好吗?
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