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[标本处理] 样品处理后,标记不上荧光

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 楼主| 发表于 2021-4-28 19:27:04 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
     如题,希望板块没有选错,第一次尝试做胞内蛋白检测,但是始终没有标记成功荧光。
     主要过程是加得到细胞悬液后,加细胞固定液室温固定10分钟,然后加0.1%triton室温孵育10min,加20μl 一抗(20μg/ml,母液稀释50倍)室温孵育30min,再加200μl稀释好的二抗(2mg/ml,稀释3000倍)4℃孵育30min,中间过程每次都用PBS清洗了两遍。以上是大致步骤,但是最终结果就是,最后的样品没有荧光,上机后,在目的荧光通道的峰很低(不知道这样描述准不准确),在荧光显微镜下观察,只有一两个细胞有荧光。所以想请教一下老师们,会不会是操作步骤哪里有问题,导致荧光没有标记上,比如二抗孵育时间过短,或者一抗就没有结合上?或者用什么方法可以验证我是哪一步有问题。
     一抗二抗的稀释浓度是来自抗体说明书的建议,孵育时间是来自抗体官网的protocol。

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 楼主| 发表于 2021-4-28 19:40:59 | 显示全部楼层
我自己有个想法就是,提高二抗的浓度,感觉一抗和二抗的浓度差距过大,然后增长一点孵育时间,改为1-2小时。

第一天的细胞没有标记成功,我在4℃放置过夜,第二天再用二抗标记一下,不知道可不可行。
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发表于 2021-4-29 09:14:12 | 显示全部楼层
Yooooo 发表于 2021-4-28 19:40
我自己有个想法就是,提高二抗的浓度,感觉一抗和二抗的浓度差距过大,然后增长一点孵育时间,改为1-2小时 ...

洗涤和抗体反应步骤都应含破膜剂。你再试试
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发表于 2021-4-29 10:51:44 | 显示全部楼层
中间洗涤过程不应使用PBS洗涤,应采用透膜液
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发表于 2021-4-30 10:43:35 | 显示全部楼层
1、你用了什么细胞固定液?浓度多少?
2、固定时间建议延长到15~20分钟。
3、固定之后,建议PBS洗涤1~2次。
4、Triton能破膜,但是不知道你是自己配制还是购买的,浓度很关键。如果仍无效,可适当提高。
5、建议胞内染色步骤,先用某个已知阳性的样本,先做性能验证,确保没问题之后,再去做这种未知的样本。
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 楼主| 发表于 昨天 17:17 | 显示全部楼层
tiger 发表于 2021-4-29 09:14
洗涤和抗体反应步骤都应含破膜剂。你再试试

好的好的,谢谢。是直接用破膜剂稀释抗体吗?
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 楼主| 发表于 昨天 17:18 | 显示全部楼层
Arial 发表于 2021-4-29 10:51
中间洗涤过程不应使用PBS洗涤,应采用透膜液

好的 ,谢谢。
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 楼主| 发表于 昨天 17:28 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-4-30 10:43
1、你用了什么细胞固定液?浓度多少?
2、固定时间建议延长到15~20分钟。
3、固定之后,建议PBS洗涤1~2次。 ...

细胞固定液应该没问题,是直接买好的,实验室做染色就是这种。
其余的我再试试。
还有,想问一下老师,验证细胞内部的蛋白(有的细胞有,有的细胞没有,结果的直方图是不是应该是两个峰啊,一个阳性,一个阴性?但是,我的结果就都是只有一个峰,那是不是可以认为这是阴性峰,因为这个目的蛋白据实验室其他人说,可能很难检测出来,表达量很少。)
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发表于 昨天 17:29 | 显示全部楼层
Yooooo 发表于 2021-5-7 17:17
好的好的,谢谢。是直接用破膜剂稀释抗体吗?

破膜剂洗涤后,破膜剂100ul重悬,加入抗体就行了。
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 楼主| 发表于 昨天 17:31 | 显示全部楼层
tiger 发表于 2021-5-7 17:29
破膜剂洗涤后,破膜剂100ul重悬,加入抗体就行了。

这个抗体是指稀释后的抗体吗?那这样不就相当于又把抗体稀释了?
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