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[淋巴细胞亚群] 巨噬细胞-流式

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发表于 2021-5-14 19:39:35 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
现在做巨噬细胞向成纤维细胞表型转化的流式,但是出了很多问题。
1.使用细胞为RAW264.7细胞系以及提取的骨髓来源的巨噬细胞,但是两者都是F4/80(巨噬细胞标记物) 阳性很低,大概30%左右(且单阳性表达基本为0,),而α-SMA阳性率很高,85%以上,细胞问题?抗体问题?RAW264.7为第7、8代,F4/80抗体是FITC通道,SMA为APC通道,biolegend公司。
2.固定和破膜问题:本次并没有固定和破膜,但是F4/80在膜表达,SMA在细胞质表达较多。
3.封闭问题:最近查阅得知巨噬细胞表面有较多FC受体表达,需要封闭,请问封闭影响大吗?有国外的老师指导说没有封闭结果也很好。
                  如果封闭,除了用CD16/CD32,血清封闭效果如何,若是直接染色法,血清种属怎么选择;若是间接染色,血清种属怎么选择?
4.抗体孵育时,是在4度还是室温25左右孵育效果更好一些?
5.死细胞对染色结果的影响?是否需要染色前先去除死细胞,还是在圈门的时候去除呢?在染色过程中怎么保持细胞活性呢?
6.后期还需要进行巨噬细胞的分型检测M1和M2,希望能先学习一下大家的经验。
刚刚接触流式,小白一枚,问题很多,望各位赐教,不胜感激!!!

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发表于 2022-1-21 09:53:32 | 显示全部楼层
我也有同样的疑惑,,,同问
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发表于 2022-1-22 16:29:44 | 显示全部楼层
这个问题以前可能被忽略过去了。

主要是图形没有,不太好判断原因所在。初步看起来,应该还是细胞状态和非特异性Fc段结合的缘故。

@苏州大学  你的问题是什么?可以发新帖,附上相关数据讨论。
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发表于 2022-1-24 15:33:45 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2022-1-22 16:29
这个问题以前可能被忽略过去了。

主要是图形没有,不太好判断原因所在。初步看起来,应该还是细胞状态和非 ...

主要是想问一下老师,巨噬细胞如何消化下来方便进行流式实验
我试过把细胞刮下来或者多次消化,细胞存活率都在百分之五十以下
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发表于 2022-1-24 15:39:35 | 显示全部楼层

对于有Fc受体表达的固有免疫细胞,一般是需要封闭的。用血清封闭效果也是可以的。直接染色时,血清种属是根据抗体的种属来源确定的, 比如你的抗体是山羊抗鼠的,你要用山羊血清封闭。间接标记,是根据一抗的种属来源确定的。
抗体孵育温度最好能按照说明书进行。
如果在染色过程中需要保持细胞活性,可以在染色缓冲液中加2%胎牛血清。
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发表于 2022-1-25 08:41:10 | 显示全部楼层
苏州大学 发表于 2022-1-24 15:33
主要是想问一下老师,巨噬细胞如何消化下来方便进行流式实验
我试过把细胞刮下来或者多次消化,细胞存活 ...

单次短时间消化加上刮是否能提高活力?
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