DIVA分析和Canto软件分析的绝对计数结果差异很大

Fish形影单只

各位老师，求指教。使用Canto软件分析的淋巴细胞绝对计数是2006.83个/ul。上完机以后，还是用的这个绝对计数管用DIVA软件重新跑了以后圈门来计数，淋巴细胞圈下来7357，Bead圈下来1430，Bead总数是48150，加的50ul全血，450ul溶血素。用公式计算下来是4954个/ul。不知道问题出在哪里呢。

niwanmao

Canto软件是不是有图的？或者 把Canto生成的FCS你也用Diva软件分析一下，看看图形上是否本身有差异 ？

Fish形影单只

niwanmao 发表于 2021-5-18 16:43
Canto软件是不是有图的？或者 把Canto生成的FCS你也用Diva软件分析一下，看看图形上是否本身有差异 ？ ...

倪老师，我导出来看了一下，图形上没有差异，就是微球的量有差异，Canto软件的微球数量比我用Diva软件跑出来的多。我下次试试调节阈值试试。

tiger

Fish形影单只 发表于 2021-5-19 09:48
倪老师，我导出来看了一下，图形上没有差异，就是微球的量有差异，Canto软件的微球数量比我用Diva软件跑 ...

是不是Beads粘连造成的。

Fish形影单只

niwanmao 发表于 2021-5-18 16:43
Canto软件是不是有图的？或者 把Canto生成的FCS你也用Diva软件分析一下，看看图形上是否本身有差异 ？ ...

倪老师，我找到问题了。Canto软件是用Percp-Cy5.5设置的的阈值，我按照Canto设置的阈值可以重复结果了。但是又有新问题了，为什么会用Percp-Cy5.5来设置阈值啦？Bead的Percp-Cy5.5荧光这么强，就算我阈值设置有问题，也不至于屏蔽掉这么多微球吧？

Fish形影单只

tiger 发表于 2021-5-19 14:06
是不是Beads粘连造成的。

不是的，因为我是用的同一管，先用Canto软件跑了接着用Diva软件跑。现在问题找到了，是阈值设置问题。

niwanmao

Fish形影单只 发表于 2021-5-19 15:57
倪老师，我找到问题了。Canto软件是用Percp-Cy5.5设置的的阈值，我按照Canto设置的阈值可以重复结果了。 ...

你看看Percp-cy5.5通道上，微球有没有被切掉，如果被切了，就不适合了。

Fish形影单只

niwanmao 发表于 2021-5-19 16:03
你看看Percp-cy5.5通道上，微球有没有被切掉，如果被切了，就不适合了。

没有被切掉，所以感觉很困惑。最开始只设置了FSC的阈值，还是最低的200。导入了FCS文件才看到DIVA设置的是Percp-Cy5.5的阈值800。

niwanmao

Fish形影单只 发表于 2021-5-19 16:22
没有被切掉，所以感觉很困惑。最开始只设置了FSC的阈值，还是最低的200。导入了FCS文件才看到DIVA设置的 ...

回顾了上面的结果，感觉可能是后来取的这个样本，Beads被切了，看一下FSC/SSC图看看。

Fish形影单只

niwanmao 发表于 2021-5-19 16:48
回顾了上面的结果，感觉可能是后来取的这个样本，Beads被切了，看一下FSC/SSC图看看。 ...

FSC/SSC图没有区别，就是Percp-Cy5.5阈值的问题，可能是这个微球的设置就是这样吧。