查看: 505|回复: 0
收起左侧

[流式protocol] 小鼠肝脏巨噬细胞组成的精细分型

  [复制链接]
 楼主| 发表于 2021-5-19 15:53:49 | 显示全部楼层 |阅读模式

亲爱的FLOWER,加入流式中文网,一起讨论,一起学习,享受更多福利吧!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?加入流式中文网

x
近年来,在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发病过程中,越来越多的研究发现肝脏存在巨噬细胞多样性明显增加。

在这里,Daemen S等人在STAR Protoc.为我们大家提供了一个详细的方案,用于分析非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和早期非酒精性脂肪性肝病(NASH)小鼠的肝巨噬细胞亚群。这些方法可以用来评估NASH过程中巨噬细胞亚群的组成和定位。整体流程如下:
2021-05-18_11-16-42.jpg

其中的免疫荧光用于分析定位,我们这里只编译一下流式这一块的方法。

前面的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠建模步骤、肝脏灌洗、试剂和仪器耗材等,在此不编译,需参考的FLOWER请参见原文:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8102804/pdf/main.pdf

灌洗过之后的肝脏,血液冲洗干净了,局部的巨噬细胞会更纯粹。
2021-05-19_15-09-17.jpg

这里只介绍肝组织处理和流式染色、分析步骤。

肝组织酶解离为单细胞悬浮液
本步骤描述了胶原酶A消化和差速离心肝组织制备单细胞悬液用于流式细胞术的过程。约需1.5小时。
注:此步骤后得到的细胞悬液也可用于其他用途,例如流式分选、单RNA测序和/或体外功能分析。
步骤可直接参考下图,很清楚:
2021-05-19_15-23-52.jpg


流式抗体染色
约需2小时。这一步详细介绍了用流式细胞术对肝脏NPC(非实质细胞)进行染色以区分巨噬细胞各亚群(Kupffer细胞、单核细胞-KCs、肝脂相关巨噬细胞和单核细胞)的方法。关键标记包括CD45、CD11b、F4/80、TIM4、VSIG4、CLEC2、Ly6C和MHCII。
2021-05-19_15-33-07.jpg
可选:根据实验需求,可以添加额外的标记,例如树突状细胞的CD11c、中性粒细胞的Ly6G和/或嗜酸性粒细胞的Siglec F。

注:该染色方案利用Zombie Aqua在表面标记染色之前评估细胞的存活/死亡状态,因此在步骤3中要求细胞悬液中不含BSA。也可以用DAPI区分死活细胞。对于DAPI染色,将染色细胞重新悬浮在1×DAPI溶液中的FACS缓冲液中。

1、用台式离心机在650×g、4℃离心3.5分钟。
2、如果细胞在含有BSA的缓冲液中,用不含BSA的PBS洗涤并重悬。
3、用100uLZombie Aqua溶液按1:250稀释度,在PBS中进行活/死细胞染色染色。置冰上避光孵育15分钟。
4、在细胞悬液中加入700uL FACS缓冲液洗涤细胞。650×g、4℃离心3.5分钟。去上清。
5、用10uL Fc阻断液将细胞重悬。在冰上避光孵育5分钟。
6、在细胞悬液中加入90微升抗体预混物。在冰上避光孵育至少45分钟(方案如下)。
7、在细胞悬液中加入700uL FACS缓冲液洗涤细胞。650×g、4℃离心3.5分钟。去上清。以300ul FACS缓冲液重悬,再次过滤。
8、上机获取。


设门步骤

2021-05-19_15-34-30.jpg

(A)对CD45阳性细胞、活细胞和单细胞进行设门后,肝巨噬细胞可被鉴定为 F4/80 hi, CD11b int细胞(橙色门)。
(B)在标准饲料喂养的小鼠中,几乎所有的肝巨噬细胞都是常驻的TIM4 hi Kupffer细胞(绿色门)。相比之下,非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝脏则有大量招募的TIM4 lo单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs)(红框)。
(C)TIM4lo巨噬细胞可进一步细分为VSIG4 hi单核细胞-KCs(Mo-KCs)和VSIG4lo脂质相关巨噬细胞(LAMs)。使用CCR2-或CX3CR1-GFP报告小鼠也有助于识别CCR2/CX3CR1-GFP阳性LAMs(C-LAM)。
(D)虽然大多数肝巨噬细胞是CLEC2 hi,但在TIM4lo、VSIG4lo MDMS中也可以鉴定出CLEC2lo亚群。这些CLEC2lo巨噬细胞表达高水平的CCR2/CX3CR1。
(E)单核细胞可通过随后的CD11b hi、MHCII lo、Ly6c hi和SSC-A小的门来识别。在CD11b hi、MHCII lo、Ly6c hi门中,用报告基因小鼠也可分出CCR2/Cx3cr1hi细胞。


最后,该protocol原文PDF中,附上了一些实验中可能遇到的问题及其应对方法,大家可直接查阅原文PDF(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8102804/pdf/main.pdf

参考文献:Daemen S, Chan MM, Schilling JD. Comprehensive analysis of liver macrophage composition by flow cytometry and immunofluorescence in murine NASH. STAR Protoc. 2021 Apr 29;2(2):100511. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100511. PMID: 33997821; PMCID: PMC8102804.
你知道活性/增殖/凋亡/焦亡/自噬的区别吗?——点击了解细胞健康检测全面方案
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2021-8-2 00:53

Powered by Discuz! X3.4

© 2001-2013 Comsenz Inc.