细胞脂质染色，尼罗红单染荧光检测，结果向大家求助！

zxt2009

向各位老师、站友求助，前后2次尼罗红检测，第一次测试在上机过程中观察和后续结果在FJ里分析感觉非常好。第二次结果在上机过程就很很奇怪，尤其是正常组PI/Count峰图，不像第一次在10^3明显，而是集中在了10^5处，理论上正常组应该不会有那么强的染色的，已附上结果。尼罗红我设置是PI通道，BD流式机器，细胞是HK-2贴壁细胞系，采用高脂造模，检测脂质含量，尼罗红染料终浓度是340nm/L，消化重悬细胞后染色15分钟，然后1500转离心5分钟，然后PBS洗1次，1500转再离心5分钟，PBS重悬，过300目网后上机（染料浓度查文献得到，第一次做也是这浓度，感觉不错，第二次直接懵逼）。
希望大家能帮看看分析一下，感谢！
最后在放两张两次正常组染色和模型组染色对比

第一次：
NC：


模型：


第二次：
NC：


模型：

tiger

zxt2009 发表于 2021-6-11 00:55
是的，兄弟，我第二次本来最开始是用的第一次电压，但是发现很多细胞压边，搞得我也很奇怪，毕竟处理细胞 ...

第二次的PI电压也调高了，所以超出了。

niwanmao

是不是仪器的稳定性出了问题？有没有事先用微球确认过信号稳定性？

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-6-9 09:23
是不是仪器的稳定性出了问题？有没有事先用微球确认过信号稳定性？

倪老师好，谢谢您的回复，这个问题我不太清楚，我们学校是BDFACSVerse，您看着这个结果像是仪器稳定性不好的原因造成的吗？我没有用过微球，不太清楚。

niwanmao

zxt2009 发表于 2021-6-9 16:55
倪老师好，谢谢您的回复，这个问题我不太清楚，我们学校是BDFACSVerse，您看着这个结果像是仪器稳定性不好 ...

如果你确认染色时样本的细胞密度、染料的浓度和用量，都保证一致，那么只剩下仪器的稳定性问题了。

tiger

zxt2009 发表于 2021-6-9 16:55
倪老师好，谢谢您的回复，这个问题我不太清楚，我们学校是BDFACSVerse，您看着这个结果像是仪器稳定性不好 ...

你两次的电压不一致，第二次比你第一次高了好多。

zxt2009

niwanmao 发表于 2021-6-9 21:26
如果你确认染色时样本的细胞密度、染料的浓度和用量，都保证一致，那么只剩下仪器的稳定性问题了。 ...

好的，谢谢倪老师，我明天再做一次看看，我后面也咨询了一下BD技术，让我每次都做一下阴性组确认一下，谢谢！

zxt2009

tiger 发表于 2021-6-10 15:23
你两次的电压不一致，第二次比你第一次高了好多。

是的，兄弟，我第二次本来最开始是用的第一次电压，但是发现很多细胞压边，搞得我也很奇怪，毕竟处理细胞过程是一致的，然后我就用NC组（染色的）微调了一下FSC-A和SSC-A的电压，FSC-A电压第二次我记得微调成了130(第一次84），SSC-A好像也是高了20多，然后正常组细胞大部分到了中间，但是为啥第二次不论NC组还是模型组，PI通道大部分荧光信号只在10^5那里被采集到呢？？？？我就很迷惑了。。。。

niwanmao

zxt2009 发表于 2021-6-11 00:55
是的，兄弟，我第二次本来最开始是用的第一次电压，但是发现很多细胞压边，搞得我也很奇怪，毕竟处理细胞 ...

如@tiger 站友所说，电压是关键。电压高，自然信号会跑出去。压边的信号，一般是跟仪器液路干净程度有关，如果你电压调好了，就尽量不动，除非机器发生重大改变。

zxt2009

tiger 发表于 2021-6-10 15:23
你两次的电压不一致，第二次比你第一次高了好多。

感谢兄弟，我其实第二次并没有调节过荧光电压，我估计问题确实在这里，我下次手动设置为第一次的值，再次感谢。