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[细胞因子检测] 检测PBMC中分泌4种细胞因子的多功能细胞遇到的问题

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发表于 2021-6-18 12:23:05 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏3流星未解决
有没有小伙伴做过多细胞因子流式呀?自己正在做,遇到了几个问题请教下大家。我做的是PBMC,检测分泌四种细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α和CD107a)的细胞,共8色(还标了死活染料、CD3、CD4和CD8).
1.我刚开始用PMA/ionomycin作为阳性对照,刺激后发现除了CD4内吞外,细胞因子的表达分群也不明显,图1是IFN-γ和CD107a结果,已经算阳性较多了,IL-2和TNF-α表达更弱,和我用特异肽段刺激(图2)的实验组结果也差不多,请问这是什么原因呀,是我抗体用量不对吗(我是按技术支持推荐用量做的,没有滴定),还是本来就是这样的呀
后来用OKT3刺激(图3),好像IFN-γ和CD107a表达强了点,IL-2和TNF-α还是很弱,而且CD3标记不表达了?(图4),但CD4和CD8表达.

2.圈门时本来是根据某个分群明显的标本来圈的(图5),然后直接copy到其它标本,发现有的标本比较合适,有的不合适(图2),这是为啥呀?

3.我想统计下分泌1、2、3、4种细胞因子的各种细胞所占的百分比,按我现在圈门方法的话(图6),导出的数据有16种细胞,包含了全阴细胞的比例,有什么方法可以将这种细胞排除在外吗?还是必须现在这样导出来,再在Excel自己计算?

PMA刺激.png
特异肽段刺激.png
OKT3刺激.png
CD3不表达.png
圈门1.png
圈门策略.png
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发表于 2021-6-18 13:39:43 | 显示全部楼层
1、分群看上去没有问题。至少CD3结合不上,可能因为你用OKT3刺激后,表位被结合了,导致标记不上。
2、刺激后,有必要做FMO,用于帮助设门的。
3、可以导出后,在Excel中计算。
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 楼主| 发表于 2021-6-20 16:54:10 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-6-18 13:39
1、分群看上去没有问题。至少CD3结合不上,可能因为你用OKT3刺激后,表位被结合了,导致标记不上。
2、刺激 ...

那倪老师,PMA/Ionomycin和OKT3刺激作为阳性对照时,4种细胞因子的表达不会阴阳分群很明显吗?像CD8一样
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发表于 2021-6-21 07:39:26 | 显示全部楼层
Eugene 发表于 2021-6-20 16:54
那倪老师,PMA/Ionomycin和OKT3刺激作为阳性对照时,4种细胞因子的表达不会阴阳分群很明显吗?像CD8一样: ...

你这些分群已经很好了
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 楼主| 发表于 2021-6-21 08:53:32 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-6-21 07:39
你这些分群已经很好了

好滴好滴,谢谢倪老师!
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 楼主| 发表于 2021-6-22 09:08:29 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-6-21 07:39
你这些分群已经很好了

倪老师,还有两个问题请教下您:
1.胞内因子染色加阻断剂的时间,我看文献中有的是和刺激剂同时加,有的是刺激1h后加阻断剂,是都可以吗?
2.CD107a染色看说明书上是破膜后染,我做了后发现,这样不加刺激的阴性对照CD107a表达也很强,后来看文献里是在刺激细胞时加CD107a抗体,这样做确实阴性对照是不表达的,这是为什么呢?
谢谢!
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