小鼠肿瘤Treg细胞流式染色

zxy714142006

请教下各位老师和同学，我想用流式检测下小鼠肿瘤中Treg细胞，买了ebioscience的固定破膜试剂盒，抗体使用的是CD4-FITC CD25-APC FOXP3-PECY5.5，第一次做Treg，不知道为啥好像没做出来，后面的也不分群
固定破膜在上机时候，感觉明显淋巴细胞那一群在散点图上都看不出来了，同样的样品，我还做了CD3 CD4 CD8和巨噬细胞的染色，这些样品中淋巴细胞的分群还是比较明显，整个染色过程洗的次数比较多，好像确实把细胞洗走了一部分。图上就是同一个肿瘤取的样品，直接染色巨噬细胞的和固定破膜染色Treg的，形状确实变了
想请教下大家这种情况我下次做的时候该怎么改进？请大家提提建议和意见，谢谢大家！
我目前想的一些方法：1.使用淋巴细胞分离液先把肿瘤部位的淋巴细胞提取出来；2.加大未染色时细胞的用量；3. CD3也染上；4. 下次做的时候染个小鼠的脾试试操作方法和技术上有没有什么问题

niwanmao

如果第一次做核内标记，我的建议是先用小鼠血样做，这样相对容易些，这个时候看做出来的图形是否好，如果图形好，那么再做组织的，那时候就能知道是组织解离的问题，还是破膜的问题。

zxy714142006

niwanmao 发表于 2021-6-18 21:36
如果第一次做核内标记，我的建议是先用小鼠血样做，这样相对容易些，这个时候看做出来的图形是否好，如果图 ...

我目前还从没做过血样的，我先大概了解下，可以先做脾的试试吗

niwanmao

zxy714142006 发表于 2021-6-18 21:41
我目前还从没做过血样的，我先大概了解下，可以先做脾的试试吗

血样好做，所以作为摸索操作手法、条件，容易找出问题，是最合适的。
如果直接做脾脏，影响因素太多，所以一旦染不出，很难确定问题所在。

鲁晶晶

老师您好，我做的Treg出来也是分群和其他细胞不太一样，请问您解决了吗

niwanmao

鲁晶晶 发表于 2021-6-28 14:18
老师您好，我做的Treg出来也是分群和其他细胞不太一样，请问您解决了吗

帖子提到的试剂盒，相对来说还是比较靠谱的，所以原因基本上都在处理的细节上，建议先拿比较容易做的样本上手，等操作细节完善、结果稳定了，再做组织这种高难度的。
小鼠的血太少，可取日常检验科剩余的血做人Treg先。

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请问楼主问题解决了吗？最近也想做肿瘤组织Treg

qian倩

对于组织肿瘤样本的检测，建议加入CD45帮助圈出白细胞，在肿瘤组织中白细胞含量，没有圈门抗体不容易区分。

pc627901478

前几天拿肿瘤组织制备单细胞悬液，单染管上机都看不到阳性细胞，我们组开始考虑先磁珠分选对CD45细胞提纯再染色上机

刘野

pc627901478 发表于 2021-9-7 19:26
前几天拿肿瘤组织制备单细胞悬液，单染管上机都看不到阳性细胞，我们组开始考虑先磁珠分选对CD45细胞提纯再 ...

请问用肿瘤组织是怎么制备单细胞悬液的，我做过一次，感觉非常不好，用到的酶也感觉消化的并不是很完全。