Flowjo的kinectic功能

malizewski

人外周血样本，标记Fura red（PerCP-Cy5.5）和Fluo4，以及CD56，CD3，PI，上机30s，分析CD56+CD3-细胞群，用flowjo的kinetic功能，横轴是时间，纵轴是Fluo4/Fura red，正常是不规则曲线（如图正常），但是最近一直是一条直线（如图异常），可能是什么原因呢？

niwanmao

这个太难回答了，因为其它所有的图形不知道，原始数据也没有。

malizewski

niwanmao 发表于 2021-6-19 19:12
这个太难回答了，因为其它所有的图形不知道，原始数据也没有。

倪老师，我通过Fura red和Fluo4荧光标记染色，分析外周血CD56+CD3-细胞静息状态下钙离子浓度。最近实验发现，Fura red荧光信号一直处于3000（横轴是time，纵轴是Fura red），和前几次差异很大（前几次是100以下），我以为是试剂有问题，重新更换试剂，做出来结果还是这样，Fura red值很大，导致最后结果Fluo4/Fura red比值均小于1，请问这个可能是什么原因呢?实验操作过程都一样，外周血提取PBMC，然后标记FLuo4、Fura red，洗涤后标记CD3、CD56，最后上机30s
，

niwanmao

malizewski 发表于 2021-6-28 22:34
倪老师，我通过Fura red和Fluo4荧光标记染色，分析外周血CD56+CD3-细胞静息状态下钙离子浓度。最近实验发 ...

得看你原始数据。如果这两个通道，都获取到了信号，即使同一份样本获取两次，都会有波动。所以一条直线，有两种可能：
1、这两个通道未获取到信号。
2、计算公式出错了。

malizewski

niwanmao 发表于 2021-6-29 08:28
得看你原始数据。如果这两个通道，都获取到了信号，即使同一份样本获取两次，都会有波动。所以一条直线， ...

倪老师，我把原始流式数据（1个文件）发给您，请您帮我看看可以吗

niwanmao

malizewski 发表于 2021-6-29 15:44
倪老师，我把原始流式数据（1个文件）发给您，请您帮我看看可以吗

可以点此回复的时候，切换到「高级模式」，然后在高级模式的编辑器工具栏上，可上传「附件」（FCS文件先压缩为zip文件）。

malizewski

niwanmao 发表于 2021-6-30 07:40
可以点此回复的时候，切换到「高级模式」，然后在高级模式的编辑器工具栏上，可上传「附件」（FCS文件先 ...

倪老师，我分析CD56+CD3-细胞群，横轴是时间，纵轴是Fluo4(FITC)/Fura red(PerCP-Cy5.5)，用kinetic模块，结果就是一直线，不知道是什么原因

niwanmao

malizewski 发表于 2021-6-30 08:39
倪老师，我分析CD56+CD3-细胞群，横轴是时间，纵轴是Fluo4(FITC)/Fura red(PerCP-Cy5.5)，用kinetic模块 ...

首先发现碎片确实多。
其次，该比例确实基本上呈直线，但是有少许波动的，可能flowjo的kinetic模块计算的是平均值，所以这少量的信号波动，不会改变平均值。

malizewski

niwanmao 发表于 2021-6-30 22:16
首先发现碎片确实多。
其次，该比例确实基本上呈直线，但是有少许波动的，可能flowjo的kinetic模块计算的 ...

谢谢倪老师。想再请教一下，这个一直线几乎是在0的位置，从比值上看，Fluo4/Fura red，Fura red的值很高，3000以上，而Fura red结合钙离子后，荧光强度会下降，那是否可以认为，导致这种一直线的，是试剂因素吗？或者是实验操作因素？另外还想请教，通过比较不同样本的Fluo4/Fura red，是否可以反映不同样本细胞内相对钙的高低呢？（因为没有加离子霉素刺激，测的是静息状态）

niwanmao

malizewski 发表于 2021-7-1 12:44
谢谢倪老师。想再请教一下，这个一直线几乎是在0的位置，从比值上看，Fluo4/Fura red，Fura red的值很高 ...

只要仪器稳定，可直接比较各自的荧光强度。
比值，也可试试吧。