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[流式protocol] OMIP-069: 用于人外周血主要细胞亚群深度免疫分型的40色方案

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 楼主| 发表于 2021-6-27 17:34:21 | 显示全部楼层 |阅读模式

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要了解免疫疗法后或对癌症、自身免疫和传染病的自然免疫反应中出现的免疫规避机制和途径,需要有能够对免疫系统进行更深入分析的方法和方案。对免疫亚群进行更深入的特征分析,可以在确定目标生物标志物和开发新的治疗方法方面做出更明智的决定。

解开人类免疫反应的复杂性需要在单细胞和群体水平上进行高通量、深入的分析。流式细胞仪试图满足这一需求,通过将荧光标记的抗体与感兴趣的特定标记物结合,来表征单细胞的蛋白质表达。多年来,制造商通过加入额外的激光器和检测器提高了流式细胞仪的能力,允许检测每个细胞更多的标记物。同时,试剂制造商也努力提供更多的荧光素,以满足这一快速扩张领域的需求。这导致了在过去20年中方案的扩展,2004年报告了17种颜色的检测,最近几年则达到了28种颜色。随着2009年质谱技术的到来,评估的标记物数量扩大到32个,使用金属结合的抗体,最近还发表了一个使用43个标记物的方案。

Lily M. Park在2020年10月发布了一个40色的OMIP,深入分析CD4和CD8 T细胞、调节性T细胞(Tregs)、γδ T细胞、NKT样细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、嗜碱细胞、固有淋巴细胞(ILCs)和树突状细胞的比例、表型、亚群。

方案
20210627_165018.jpg

设门逻辑
我们不一定需要完全照搬,但其中的设门逻辑,对于我们日常使用,还是相当有帮助的,大家可拆分开来用。

NK细胞通过CD56(神经细胞粘附分子[NCAM])和CD16(FcγRIII)的表达来识别,而CD2被用来识别最有可能参与细胞毒性的NK细胞。方案中包含了:
- 两个天然细胞毒性受体(NCRs):NKG2D(CD314)和NKp30(CD337);
- 抑制性受体NKG2A(CD159a),免疫疗法的可能目标
- 活化受体NKG2C(CD159c)

已知与NK细胞在传染病和疫苗效应反应有关。CD57是NK细胞的成熟标志物,用于识别具有强大的细胞毒性而复制能力减少的细胞。CD56被进一步用于识别NKT样细胞,定义为CD56+CD3+,因为具有这种表型的细胞可能在感染性疾病中发挥作用。

γδT细胞被认为是固有免疫和适应性免疫系统之间的重要桥梁,因为它们的反应先于适应性免疫,使γδT细胞成为免疫系统的独特组成部分。它们还与主要的自身免疫性风湿病有关,如类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮和硬皮病。虽然我们包括CD16和CD56来定义NK细胞亚群,但CD16和CD56也与γδ T细胞的活化表型有关。γδT细胞也可通过CD45RA、CD27和CCR7表达分为效应/记忆亚群。

为了描述T细胞的特征,使用了记忆和分化标记物CD45RA、CCR7、CD27和CD28。使用CD45RA和CCR7,T细胞可以被分为初始(CD45RA+CCR7+)、中央记忆(CD45RA-CCR7+)、效应记忆(CD45RA-CCR7-)和终末效应记忆(CD45RA+CCR7-)亚群。加入CD27和CD28可以进一步细化这些亚群,确定早期效应(CD45RA-CCR7-CD28+CD27+)、早期样效应(CD45RA-CCR7-CD28+CD27-)、中间效应(CD45RA-CCR7-CD28-CD27+)、终末效应(CD45RA-CCR7-CD28-CD27-)和RA终末效应(CD45RA + CCR7-CD28-CD27-)。

其他表面标志物,包括CD127、CD95、PD-1、CD57、CD38和HLA-DR,被包括在内以进一步描述T细胞亚群。IL-7受体(CD127)参与记忆性T细胞前体的平衡增殖和存活,而CD57表明细胞衰老、不能增殖和易受激活引起的细胞死亡的影响。CD38和HLA-DR被列为T细胞活化标志物。病毒感染如HIV-1、登革热病毒或流感导致CD38+HLA-DR+活化T细胞的比例增加。PD-1和CD95在活化的T细胞中都是上调的。抑制性受体PD-1对于调节免疫反应和避免过度免疫激活至关重要。

为了识别Tregs,方案中使用了CD25(IL-2Rα)和CD127(IL-7Rα)标记,而不包括FoxP3,因为foxP3需要做核内染色。以前的研究表明,CD25hiCD127lo/-CD4+ T细胞是Tregs的一个很好的相关指标,尽管这种策略可能高估或低估了它们的比例。据报道,Tregs可以根据CD39的表达进一步分群,CD39+Tregs可能在某些自身免疫性疾病如多发性硬化症中起作用。

如前所述,选择CD27和IgD来识别初始(IgD+CD27-)、边缘区样(IgD+CD27+)和记忆(IgD-CD27+)B细胞。边缘区样B细胞可进一步分为IgM+边缘区和仅有IgD的记忆B细胞。当结合使用时,CD24和CD38可区分记忆(CD24+CD38lo/neg)、初始(CD24intCD38int)和过渡(CD24hiCD38hi)B细胞,并被用于识别调节性B细胞。浆细胞可以根据CD19、CD20、CD27和CD38的表达来鉴定。记忆性B细胞表达不同的B细胞受体同种型,这是类别转换重组的结果。方案中包括了IgG和IgM,识别血液中发现的最普遍的记忆B细胞亚群。IgA不包括在内,因为这种记忆B细胞亚群主要在粘膜相关的淋巴组织中表达,如肠道和肠系膜淋巴结。IgE被排除在这个小组之外,因为记忆B细胞的这个亚群在人类血液中几乎检测不到。

趋化因子受体对免疫细胞的迁移和定位很重要。方案中包括了CCR5、CCR6、CXCR3和CXCR5。CCR5由活化和记忆T细胞、γδT细胞和Tregs表达。在人类T细胞上,CCR6被认为是Th17(RORγt)表型。在B细胞上,CCR6的表达仅限于能够对抗原刺激作出反应的功能成熟的细胞。据报道,CXCR3是T细胞聚集在抗原呈递细胞周围和T细胞旁观者活化所必需的,也表达在γδT细胞的亚群上。CXCR5与CXCL13相互作用,促进T细胞转运到B细胞滤泡和生发中心,这些是产生高亲和力抗体反应的关键部位。此外,已经证明慢性炎症会导致外周血B细胞上趋化因子受体表达的调节。在类风湿性关节炎患者中,B细胞显示CXCR5和CCR6的表达减少,CXCR3的水平增加。

使用CD14(脂多糖结合蛋白)和CD16(FcγRIII)来区分单核细胞亚群。这两个标记物可以识别经典单核细胞(CD14++CD16-)、非经典单核细胞(CD14+CD16++)和中间型单核细胞群(CD14+CD16+)。中间型单核细胞在细胞因子和炎症的存在下会增殖。非经典单核细胞也被证明在炎症性疾病中会增殖。已经证明,在感染的过程中,首先是中间型单核细胞的增高,然后是非经典单核细胞的增高。

在该方案中,嗜碱粒细胞以CD45dimCD123+HLA-DR-设门,并可以通过评估CD38、CD95和CD25的表达来进一步确定。

方案中对于ILC的分析策略,则与OMIP-055类似,为CD45+CD127+Lin-。对于谱系标记,这里使用CD14、CD19、CD20和CD3。然而,为了充分识别这些细胞,应排除其他标记物,如CD1a、CD34、CD303和FCεR1a。尽管缺乏这些标志物,但如以前报道的那样,可以根据CD2、CD4、CCR6、CXCR3、CD27、CD28、CXCR5和CCR7的表达进一步分类确定为ILCs的细胞。

最后,为了确定主要的树突状细胞亚群,使用了CD11c、HLA-DR、CD141(BDCA-3)、CD1c(BDCA-1)和CD123。pDCs被确定谱系抗体阴性(CD3-CD19-CD56-CD14-)而HLA-DR+CD123+细胞;常规DCs被确定为CD123-CD11c+HLA-DR+,然后根据CD141和CD1c表达被进一步亚群。

OK,逻辑方面都讲完了,直接上图,由于原文的图非常大,我们为了更清晰的展现各类免疫细胞设门逻辑,将其拆分成11张相对较小的图。

1、去除信号不稳定区域、去粘连体、排除死细胞,然后直接分析嗜碱粒细胞:
1.jpg

2、同前,分析总单核和总淋巴:
2.jpg

3、总单核可分为三个亚群:
3.jpg

4、总淋巴根据CD3和TCRγδ分为三大亚群,其中γδT又可根据CD45RA、CCR7表达分为效应/记忆亚群
4.jpg

5、CD3+TCRγδ-的T细胞,根据CD56、CD2、CD8分出NKT样细胞及其亚群:
5.jpg

6、CD3+TCRγδ-CD56-的T细胞,基本上都是αβT细胞了,通过CD4和CD8,分出四个亚群,其中辅助T分出Treg和数个功能亚群(详见前述):
6.jpg

7、细胞毒T同样分出多个功能亚群(详见前述):
7.jpg

8、接下来轮到CD3-TCRγδ-群体了,通过CD19+CD20+圈出总B细胞,然后再细分为多个B细胞亚群(设门逻辑详见前述):
8.jpg

9、CD3-TCRγδ-群体也可通过CD56/HLA-DR和CD56/CD16的逐级设门,圈出NK的三个亚群:
9.jpg

10、CD3-TCRγδ-群体还可通过CD19-CD56-CD14-、HLA-DR+,圈出DC群体,并进一步分析若干亚群(逻辑详见前述):
10.jpg

11、最后是ILC,通过各谱系抗原表达阴性、CD127+分出ILC,并进一步细分两个群体:
11.jpg


参考文献:Park LM, Lannigan J, Jaimes MC. OMIP-069: Forty-Color Full Spectrum Flow Cytometry Panel for Deep Immunophenotyping of Major Cell Subsets in Human Peripheral Blood. Cytometry A. 2020 Oct;97(10):1044-1051. doi: 10.1002/cyto.a.24213. Epub 2020 Aug 31. PMID: 32830910; PMCID: PMC8132182.

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Veblen 发表于 2021-7-7 22:00
请问一下,这是什么仪器做的数据?

原文的supplement里面写明了,是5 Laser Aurora Full Spectrum Cytometer,是光谱流式。
你知道活性/增殖/凋亡/焦亡/自噬的区别吗?——点击了解细胞健康检测全面方案
发表于 5 天前 | 显示全部楼层
Veblen 发表于 2021-7-7 22:00
请问一下,这是什么仪器做的数据?

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 楼主| 发表于 4 天前 | 显示全部楼层
lnBV421 发表于 2021-7-28 10:59
应该是光谱吧,普通流式仪器做不到这么多颜色

这里是光谱,但是也不要小看哦,常规的荧光流式也有50多色的:)
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