小鼠PBMC里检测人源T细胞

风萧易水

我在免疫健全的小鼠尾静脉分别注射1e6和2e6个人的T细胞，3h后从小鼠尾静脉取血50uL，加入5mL裂解液后用PBS洗涤，然后用anti-human APC-CD45抗体染色，想看下小鼠血液里面还剩余多少人的T细胞，结果发现T细胞在FSC-A和SSC-A里面是可以看到的，但是APC-CD45染色好像没染上，不知道哪里出了问题，可以排除的是我的APC-CD45抗体染human T细胞没问题，请各位老师帮忙分析一下。

niwanmao

首先，左侧的碎片区域实在是太多了，又是跟前些日子其它站友一样，阈值没设好。
其次，你目前认为的human T区域，反而像小鼠粒细胞区域吧？为什么不用CD45直接反设门，确定人T细胞在FSC/SSC上的区域呢？

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-7-8 07:43
首先，左侧的碎片区域实在是太多了，又是跟前些日子其它站友一样，阈值没设好。
其次，你目前认为的human T ...

我可能表述有问题，图中的对照是取小鼠尾静脉全血裂解后上的流式，没有尾静脉注射人源T细胞的是对照组，我画门的地方几乎没有细胞，后面两组是尾静脉注射了人的T细胞，同样的画门位置就有大量的细胞，后面两组我的人源T细胞数量还设置了两个剂量梯度，也是可以看到注射了2*10的6次方的细胞比前者的细胞更多的，但这似乎和CD45没有关系，只从大小就可以区分了，但好像哪里又不对。

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-7-8 07:43
首先，左侧的碎片区域实在是太多了，又是跟前些日子其它站友一样，阈值没设好。
其次，你目前认为的human T ...

我怕把人的T细胞位置圈错，我就又做了另一个实验，单独人源T细胞上样和小鼠全血与人源T细胞混合后一起上样，这样CD45是可以区分出人源T细胞的。

niwanmao

风萧易水 发表于 2021-7-8 16:00
我怕把人的T细胞位置圈错，我就又做了另一个实验，单独人源T细胞上样和小鼠全血与人源T细胞混合后一起上 ...

对，确实需要这样的对照。
这样就很明确的，前面的实验中，圈的门位置也是有点偏的，不知道你有没有发现，对照组和后面两管实验管，都存在那一群，比例上相差并不大分别是1.05、1.44、1.76，后面看的的数量增多，是因为获取的细胞总数增多了，导致细胞群似乎多起来了。
这就说明绝大多数都是小鼠本身的细胞，左右这个门偏右一点的地方，可能有微量人T细胞存在。

这样的结果，说明了实验后，人T细胞基本上不存在了。所以你后续可以考虑做一个更短时间的测试，绘制注射细胞后的动力学，明确检测时间点。

tiger

niwanmao 发表于 2021-7-9 07:38
对，确实需要这样的对照。
这样就很明确的，前面的实验中，圈的门位置也是有点偏的，不知道你有没有发现 ...

用mCD45-APC、hCD45-APC、hCD45-FITC OR hCD3-FITC 三抗体两色标记，设APC阈值，用APC圈门，分析APC/FITC双阳性细胞。优点是门控准确，最大限度去除了碎片，结果准确。

风萧易水

tiger 发表于 2021-7-9 09:14
用mCD45-APC、hCD45-APC、hCD45-FITC OR hCD3-FITC 三抗体两色标记，设APC阈值，用APC圈门，分析APC/FITC ...

老师我问下，mCD45-APC和hCD45-APC一起上的话都是APC是不是会有影响。

风萧易水

niwanmao 发表于 2021-7-9 07:38
对，确实需要这样的对照。
这样就很明确的，前面的实验中，圈的门位置也是有点偏的，不知道你有没有发现 ...

因为我注射的细胞是人的T细胞，小鼠又是免疫健全的，很可能在注射后3h内被机体清除干净了，后续我是要做CAR-T治疗免疫缺陷小鼠的，注射CAR-T后可能会在小鼠体内存留时间更长一点，所以我先在免疫健全小鼠身上做下预实验，谢谢倪老师的提点，我又有了很多灵感

tiger

风萧易水 发表于 2021-7-9 09:26
老师我问下，mCD45-APC和hCD45-APC一起上的话都是APC是不是会有影响。

没有影响

风萧易水

tiger 发表于 2021-7-9 09:38
没有影响

好的，谢谢老师解答！