如何减少样本制备过程中的细胞损失

steven

大家好，今天想问大家一个基础性的问题，在流式样本制备过程中，怎么能减少细胞的损失呢。
最近需要将流式分选出来的细胞进行再次染色后流式分析，但是卡在细胞损失这个问题上了，每次能分选出1.5x10＾6左右的细胞，然后需要分成3等份进行不同标记物的染色，但是几次离心下来啥都没有了。。。试了很多大家说的方法，比如说增加离心时间，选用1.5ml的离心管，离心后的液体倒出来而不是吸出来等等，但是并没有明显的效果，试了几次都是不行。
具体来说就是将上图中的P3和P4细胞分别选出来，然后进行固定(MeOH)，洗涤离心400g，5min，一抗染色，洗涤离心(同上)，二抗染色，洗涤离心(同上)，上样。
感觉洗涤之后细胞损失特别多，比如说固定之后离心还可以看见白色沉淀，用PBS洗了之后再离心就没有沉淀了，莫名地消失了，没有耦联抗体能用，所以只能一抗二抗分别染，多次洗涤。
怎么解决这个问题呢？继续提高细胞量吗，觉得现在已经不少了，总是在某次洗涤之后突然就没有沉淀了。
同时，我的实验目的就是比较P3和P4同一标记物的表达量多少，现在分3份的原因就是有两个标记物加上一个对照组总共3份，P3，P4分别分析后然后直接比较阳性比例。如果只是想知道两组间表达量多少关系的话，可不可以不要对照组，直接比较染色组的值高低，这样就可以减少一份样本，只做2个就行了，但是会不会P3，P4两组细胞由于细胞差异，荧光基础值不一样啊？要是这样的话还是需要对照组确定各自的基础荧光值，不能减少对照组。
大家可以分享一下经验吗，我已经想不出太好的办法了。

niwanmao

steven 发表于 2021-7-13 13:41
感谢你提供的解决方案。
我之后也加1%的BSA试一试。现在是封闭的时候用1%BSA/PBS，30min，还没有常规冲洗 ...

@Fzw  站友那个链接，作者测试的是蛮全的，不少技巧，在平时都还是有用的。不过在你这个实验里面，未经固定就用甲醇，是最最主要的破坏原因，所以先用PFA固定是正确的选择，祝实验顺利！

niwanmao

甲醇，这个是你细胞损失过多的最关键原因。

不知道你是要染什么标记，为什么用甲醇固定和破膜？

steven

niwanmao 发表于 2021-7-11 08:49
甲醇，这个是你细胞损失过多的最关键原因。

不知道你是要染什么标记，为什么用甲醇固定和破膜？ ...

谢谢倪老师回复，为什么甲醇会让细胞损失过多啊？
用甲醇是因为可以直接固定和破膜，而且免疫染色的时候效果很好，因此流式的时候就也用甲醇了。标记物一个是CD44，一个是SOX9，一个表面一个胞内，所以直接选择甲醇了。
该换用4%PFA+TritonX的组合吗？
用甲醇固定后离心细胞还挺多的，但是再PBS洗涤之后离心细胞就没有什么了，莫名消失了，难道都没有离心下来吗？
谢谢倪老师。

niwanmao

steven 发表于 2021-7-12 09:44
谢谢倪老师回复，为什么甲醇会让细胞损失过多啊？
用甲醇是因为可以直接固定和破膜，而且免疫染色的时候 ...

甲醇是非常剧烈的固定破膜试剂，破膜是最大的作用，固定反而不强，如未经多聚甲醛固定，细胞很容易破碎。
你所说的甲醇固定后离心细胞还挺多，我估计那些都已经可能是破碎细胞了，所以后续PBS一洗，就从上清中出去了。

steven

niwanmao 发表于 2021-7-12 09:50
甲醇是非常剧烈的固定破膜试剂，破膜是最大的作用，固定反而不强，如未经多聚甲醛固定，细胞很容易破碎。 ...

谢谢倪老师 原来这么回事 下回换成4%PFA+0.1%TritonX试试

Fzw

不知道能不能打开这个链接，https://lists.purdue.edu/piperma ... 6-March/030672.html，我之前也有类似细胞丢失的问题，所以当时特意研究一下，这篇讲的不错
简单整理了下有以下几个点：
1. 洗涤的PBS里面最好加点BSA/FBS，作者说他用1%BSA洗会丢~10%细胞，而用纯PBS能丢50-60%
2. 倒而不是吸（和你一样）
3. 离心机用水平转子而非固定转子
4. 提高收集离心速度/时间
5. 等其他

steven

Fzw 发表于 2021-7-13 10:42
不知道能不能打开这个链接，https://lists.purdue.edu/piperma ... 6-March/030672.html，我之前也有类似细 ...

感谢你提供的解决方案。
我之后也加1%的BSA试一试。现在是封闭的时候用1%BSA/PBS，30min，还没有常规冲洗的时候加BSA。
我看了你提供的帖子中作者用了EtOH固定，估计和MeOH原理差不多，会破坏掉一些细胞，所以细胞损失比较严重。因为我看别的帖子有用EtOH固定细胞做细胞周期分析的时候也是离心后没有细胞。。。
但是细胞基数大的时候，这个效果可能就不那么明显，因为总会剩下很多细胞的。
除了PBS中没加BSA，帖子中的其他方案我都采用了，但还是大量丢失细胞，估计MeOH罪魁祸首的可能性最大了，而且我固定的是FACS分选出来的细胞，可能本身状态就不行，一强刺激全都碎了。。。我刚才用4%PFA试了一下，用了很少量的细胞，效果还不错，确实细胞不那么流失了。

Fzw

steven 发表于 2021-7-13 13:41
感谢你提供的解决方案。
我之后也加1%的BSA试一试。现在是封闭的时候用1%BSA/PBS，30min，还没有常规冲洗 ...

原来是这样！学到了哈哈，谢谢！

steven

niwanmao 发表于 2021-7-14 07:39
@Fzw  站友那个链接，作者测试的是蛮全的，不少技巧，在平时都还是有用的。不过在你这个实验里面，未经固 ...

谢谢倪老师指导，昨天查资料还学到一个词，低渗休克，说用甲醇固定的时候要特别注意，估计是剧烈反应破坏了大量细胞，下次换PFA。