查看: 130|回复: 8
收起左侧

[凋亡检测] AV/PI凋亡双染的问题,恳请各位大佬指点,也欢迎各位讨论

[复制链接]
 楼主| 发表于 2021-7-17 01:08:00 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 zxt2009 于 2021-7-17 01:09 编辑

各位老师、专家、同道好,
小弟这几天在用ANNEXI V/PI双染检测细胞系凋亡,做了3次了,效果非常不理想,主要问题3个:①正常组检测发现凋亡过多,但是镜下观察细胞状态良好;②AV-FITC染色,细胞分群不明显;③双染细胞AV-FITC分群不明显,现在把自己的操作步骤写出来,希望各位老师、同道能给与指点帮助,也欢迎大家讨论,谢谢。
步骤:
1. 6孔板培养细胞系至处理结束(24h),把细胞上清液收集到5ml管子;
2. 1XPBS 1ml洗细胞1次,PBS收集至5ml管子;
3. 0.25%胰酶(NO EDTA)0.5ml/孔,大致消化3分钟;
4. 用管子里对应的上清终止消化,胰酶加入5ml管子,吹下细胞并转移至5ml管子(吹下细胞的过程,感觉正常组细胞相对贴壁较稳,比模型组和单染组吹次数更多,不知道是不是对正常组有了很大影响,也欢迎大家分享贴壁细胞胰酶消化收集的心得,此外我用的是1ml枪吹,是否应换做200ul枪吹下细胞?);
5. 2000离心转速,5分钟,沉淀细胞(这个过程不知道2000转速是否过大?我看有的实验协议是300g大约1300-1500转速,有的是500g甚至碧云天说明书提到1000g离心。。。。,大家的经验是什么呢?
6. 弃掉上清液,加入2%胎牛血清的1X PBS 1ml,不吹打,直接1500离心转速,5分钟,洗涤+沉淀细胞1次;
7. 弃掉上清液,加入195ul Buffer,5ul AV-FITC染液,室温避光15分钟;
8. 补加200ul Buffer,5ul PI染液,冰上放置5分钟,上机;

下面是本次实验图片,只做了AV-FITC单染、阴性对照双染、模型双染(PI单染和空白对照沿用过去实验的数值),本次的问题还有1个,离心、洗涤过程中丢失了细胞,所以AV单染和阴性对照细胞很少,模型组没有丢失细胞,收集数量足够。

下面是本次实验原始文件

最后是自己的反思,AV-FITC染色后细胞不分群,最开始公司技术提示稀释AV-FITC染料5倍后使用,本次是稀释后使用的,比之前稍微有了分群趋势,但仍然不明显,根据论坛倪老师提到的,凋亡双染细胞分群应该很明显,我自己反思是否还是染料浓度过大,有了太多非特异染色?考虑继续稀释染料至10倍再用阴性双染组和单染组试试?



问题图片,从左到右,依次:AV-FITC单染、阴性双染、凋亡模型双染

问题图片,从左到右,依次:AV-FITC单染、阴性双染、凋亡模型双染

原始文件.zip

1.92 MB, 下载次数: 1

你知道活性/增殖/凋亡/焦亡/自噬的区别吗?——点击了解细胞健康检测全面方案
发表于 2021-7-17 09:24:45 | 显示全部楼层
贴壁细胞做Annexin V/PI,是个很大的难题。因为 胰酶消化时,很容易造成PS外翻,造成很多假阳性,导致AV+PI-细胞增多。

所以你的图就显示了这个bug。

那么,是否有解决方案呢?有的,1996年的这篇老文献,就给出了较好的方法:A Novel Assay to Measure Loss of Plasma Membrane Asymmetry During Apoptosis of Adherent Cells in Culture其实很简单,就是在胰酶消化前,先用Annexin V与细胞孵育3分钟(但由于Annexin V的结合依赖钙离子,建议此时可以用缓冲液孵育),然后再收集上清、洗涤,贴壁的部分再进行常规消化、收集,最后集中到一起,染PI。
20210717_091958.png
流式中文网FlowGuard®流式专用保存液,无需冻存,稳定保护各类流式样本,从容完成实验
 楼主| 发表于 2021-7-17 15:28:23 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-7-17 09:24
贴壁细胞做Annexin V/PI,是个很大的难题。因为 胰酶消化时,很容易造成PS外翻,造成很多假阳性,导致AV+PI ...

谢谢倪老师,我详细看了这个文献,似乎这个文献最后的结果并不支持用胰蛋白酶消化,任何胰蛋白酶消化后的结果全部不好,作者用细胞刮刀在收集细胞似乎效果更好。
作者是先用 AV-biotin结合细胞外翻PS,然后刮刀收集,然后再用FITC标记的链霉素结合,然后AV-FTIC探针再染色,显示刮刀效果最好,我试试再说,再次感谢倪老师提供的文献。
文章表格.png
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2021-7-19 00:05:45 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-7-17 09:24
贴壁细胞做Annexin V/PI,是个很大的难题。因为 胰酶消化时,很容易造成PS外翻,造成很多假阳性,导致AV+PI ...

倪老师,我尝试了用细胞刮刀收集细胞,然后染色,发现染不上。。。。,我打算换YO-PRO-1试剂,然后用只用0.5%EDTA消化贴壁细胞试试
Bangslabs、Spherotech流式微球,帮您做好仪器设置、QC、荧光定量、细胞周期
发表于 2021-7-19 07:19:35 | 显示全部楼层
zxt2009 发表于 2021-7-19 00:05
倪老师,我尝试了用细胞刮刀收集细胞,然后染色,发现染不上。。。。,我打算换YO-PRO-1试剂,然后用只用0 ...

是Annexin V染不上还是PI染不上?
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2021-7-19 11:12:26 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-7-19 07:19
是Annexin V染不上还是PI染不上?

AV,我有一个样上清液有很多飘起来的细胞,收集起来的,结果发现没有凋亡的,好奇怪啊
你知道活性/增殖/凋亡/焦亡/自噬的区别吗?——点击了解细胞健康检测全面方案
发表于 2021-7-19 13:29:44 | 显示全部楼层
zxt2009 发表于 2021-7-19 11:12
AV,我有一个样上清液有很多飘起来的细胞,收集起来的,结果发现没有凋亡的,好奇怪啊 ...

binding Buffer用了没? 还是染色过程中碎了?
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
 楼主| 发表于 2021-7-21 02:47:07 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-7-19 13:29
binding Buffer用了没? 还是染色过程中碎了?

用了的,倪老师,我后面在荧光显微镜下做了镜检,AV染色模型组能染上的,正常组是染不上,目前流式机器坏了,过几天我再试试,谢谢您!
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2021-7-21 13:09:57 | 显示全部楼层
你的细胞太少了 你想看到分群最基础的就是调电压和细胞数,你觉得看不到很有可能是你细胞数不够,你把样品量调10倍就能看到了Pi+ AV+的群了。 但是AV的染色我也遇到了相同的问题,感觉细胞不成团用hisgram看图也是没有明显的阴性阳性分界点 也不成团。感觉是染色没染好的原因 你确定你的protocol是冰上5min?
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2021-8-2 00:42

Powered by Discuz! X3.4

© 2001-2013 Comsenz Inc.