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[标本处理] 求助!!!小鼠脾脏Foxp3一直染不出来。

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 楼主| 发表于 2021-7-19 11:41:41 | 显示全部楼层 |阅读模式
5流星
Foxp3一直染不出来!C57小鼠脾脏,染了CD4/CD25/Foxp3,抗体都是BD的:BB700_CD4(Cat#566408)/BB515_CD25(Cat#564458)/BV421_Foxp3(Cat#562996),使用eBioscicence的Foxp3/转录因子固定破膜试剂盒(#00-5523-00)。
第一张图:第一行是样品管,第二行是FMO-Foxp3对照管。感觉Foxp3+应该有问题,CD25-Foxp3+的细胞太多了。
第二张图:第一行是Foxp3单染管,第二行是CD4单染管,第三行是CD25单染管。
第三张图:实验步骤
附件:压缩的FCS文件

第一张图:样品管

第一张图:样品管

第二张图:单染管

第二张图:单染管

第三张图:实验步骤

第三张图:实验步骤

FMO-Foxp3.zip

4.55 MB, 下载次数: 1

FMO-Foxp3

P79.zip

5.3 MB, 下载次数: 1

样品管

CD4 BB700 (Cells).zip

3.3 MB, 下载次数: 1

单染-CD4

CD25 BB515 (Cells).zip

4.7 MB, 下载次数: 1

单染-CD25

Foxp3 BV421 (Cells).zip

5.67 MB, 下载次数: 1

单染-Foxp3

Unstained (Cells).zip

5.12 MB, 下载次数: 1

空白管

你知道活性/增殖/凋亡/焦亡/自噬的区别吗?——点击了解细胞健康检测全面方案
 楼主| 发表于 2021-7-19 11:42:50 | 显示全部楼层
使用的仪器是Cytek Aurora三十八色分析型流式细胞仪
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 楼主| 发表于 2021-7-19 11:45:39 | 显示全部楼层
请各位大佬看看我哪里做的有问题,多多赐教!
因为前面有几次也做不出来,本着节省抗体,所以这次没有在表面染色前进行死活染色和Fc阻断。
组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2021-7-19 18:26:51 | 显示全部楼层
从图上看,CD4和CD25应该染的都挺好,唯一就是foxP3出不来。如果核内操作步骤都没问题,需要考虑foxP3抗体的问题了,是否能借到eb的foxP3抗体?
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 楼主| 发表于 2021-7-19 21:34:22 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-7-19 18:26
从图上看,CD4和CD25应该染的都挺好,唯一就是foxP3出不来。如果核内操作步骤都没问题,需要考虑foxP3抗体 ...

Foxp3抗体可能借不到。。。这个会不会和我Foxp3抗体使用的量太多(4μL)有关系,因为感觉整体都偏Foxp3+?核内步骤我就是按实验步骤做的,应该说没有问题,就是不知道时间是否需要延长?这个Foxp3抗体的问题是和固定破膜试剂盒不适合还是说抗体坏了?
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发表于 2021-7-20 07:51:30 | 显示全部楼层
请叫我黄总 发表于 2021-7-19 21:34
Foxp3抗体可能借不到。。。这个会不会和我Foxp3抗体使用的量太多(4μL)有关系,因为感觉整体都偏Foxp3+ ...

用量不是关键。
究竟是抗体与该破膜成份不兼容?还是抗体本身有问题?就是如前所说,需要借一个EB的抗体来确认。或者干脆买EB的抗体,因为他们家的抗体和他们家的破膜剂是已经很多文献证实了的。
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发表于 5 天前 | 显示全部楼层
建议使用eB家的抗体试一下,还有为啥都是室温操作?
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发表于 4 天前 | 显示全部楼层
我刚开始做treg时也染不上foxp3,抗体是BD公司PE标记的,而且过期了2年多,后来换新抗体也不行,最后发现是固定破膜液的问题,换成ebioscience的试剂盒就染出来了,你可以借别人的试试看会不会是这个问题。
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