求助！！！小鼠脾脏Foxp3一直染不出来。

请叫我黄总 · 发表于 2021-7-19 11:41:41

Foxp3一直染不出来！C57小鼠脾脏，染了CD4/CD25/Foxp3，抗体都是BD的：BB700_CD4（Cat#566408）/BB515_CD25（Cat#564458）/BV421_Foxp3（Cat#562996），使用eBioscicence的Foxp3/转录因子固定破膜试剂盒（#00-5523-00）。
第一张图：第一行是样品管，第二行是FMO-Foxp3对照管。感觉Foxp3+应该有问题，CD25-Foxp3+的细胞太多了。
第二张图：第一行是Foxp3单染管，第二行是CD4单染管，第三行是CD25单染管。
第三张图：实验步骤
附件：压缩的FCS文件

niwanmao · 发表于 2021-7-19 11:41:42

从图上看，CD4和CD25应该染的都挺好，唯一就是foxP3出不来。如果核内操作步骤都没问题，需要考虑foxP3抗体的问题了，是否能借到eb的foxP3抗体？

请叫我黄总 · 发表于 2021-7-19 11:42:50

使用的仪器是Cytek Aurora三十八色分析型流式细胞仪

请叫我黄总 · 发表于 2021-7-19 11:45:39

请各位大佬看看我哪里做的有问题，多多赐教！
因为前面有几次也做不出来，本着节省抗体，所以这次没有在表面染色前进行死活染色和Fc阻断。

请叫我黄总 · 发表于 2021-7-19 21:34:22

niwanmao 发表于 2021-7-19 18:26
从图上看，CD4和CD25应该染的都挺好，唯一就是foxP3出不来。如果核内操作步骤都没问题，需要考虑foxP3抗体 ...

Foxp3抗体可能借不到。。。这个会不会和我Foxp3抗体使用的量太多（4μL）有关系，因为感觉整体都偏Foxp3+？核内步骤我就是按实验步骤做的，应该说没有问题，就是不知道时间是否需要延长？这个Foxp3抗体的问题是和固定破膜试剂盒不适合还是说抗体坏了？

niwanmao · 发表于 2021-7-20 07:51:30

请叫我黄总发表于 2021-7-19 21:34
Foxp3抗体可能借不到。。。这个会不会和我Foxp3抗体使用的量太多（4μL）有关系，因为感觉整体都偏Foxp3+ ...

用量不是关键。
究竟是抗体与该破膜成份不兼容？还是抗体本身有问题？就是如前所说，需要借一个EB的抗体来确认。或者干脆买EB的抗体，因为他们家的抗体和他们家的破膜剂是已经很多文献证实了的。

半年y · 发表于 2021-7-28 14:02:21

建议使用eB家的抗体试一下，还有为啥都是室温操作？

samly0 · 发表于 2021-7-29 10:38:39

我刚开始做treg时也染不上foxp3，抗体是BD公司PE标记的，而且过期了2年多，后来换新抗体也不行，最后发现是固定破膜液的问题，换成ebioscience的试剂盒就染出来了，你可以借别人的试试看会不会是这个问题。

请叫我黄总 · 发表于 2021-8-2 10:23:45

samly0 发表于 2021-7-29 10:38
我刚开始做treg时也染不上foxp3，抗体是BD公司PE标记的，而且过期了2年多，后来换新抗体也不行，最后发现是 ...

我一开始用是BD的固定破膜液，BD的Foxp3_BV421，Foxp3-群正常，但是Foxp3+群太少，然后换了eBioscience的固定破膜液，就是上面的结果

飞翔 · 发表于 2021-8-4 14:53:18

请叫我黄总发表于 2021-7-19 21:34
Foxp3抗体可能借不到。。。这个会不会和我Foxp3抗体使用的量太多（4μL）有关系，因为感觉整体都偏Foxp3+ ...

用过BD和eb的固定破膜剂都没有什么问题，Bio、BD抗体都没什么问题

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