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[结构和原理] PMA离子霉素刺激、表染CD19、固定破膜后,CD19测不出来?

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 楼主| 发表于 2021-7-21 11:20:45 | 显示全部楼层 |阅读模式
3流星
本帖最后由 shunlifasci 于 2021-7-21 11:24 编辑

各位老师好,我做的是人外周血分离的原代T-B细胞共培养体系,检测药物处理该体系后胞内因子的变化。
实验步骤:1.Ficoll分离人外周血PBMC,磁珠阴选B细胞、阳选T细胞。2、将分选的B细胞分三管(编号:①②③),①管B细胞培养3d检测表明marker(10%FBS培养,无活化剂),②管B细胞在anti-IgM+CD40L+IL4条件下活化5d,检测胞内因子变化;③管的B细胞先用anti-IgM预处理48h后与T细胞共培养(体系含包被的anti-CD3/CD28),5d后检测T、B细胞胞内因子改变。
②③管检测胞内因子时,用PMA+离子霉素刺激4-6h(加入BFA和莫能菌素)——洗,染色死活—Fc block—染色表面CD19,20min—(ebiosceice试剂)固定破膜液500ul 30min——1ml破膜buffer,500g,5min——染色胞内因子——洗,上机分析。
目前问题:同样的分选后的B细胞,管①染色后分析约85%以上的B细胞,管②管③分析B细胞,仅约个位数。比较了下不同管之间的操作,CD19抗体相同(BD,BB700-CD19),最大差异就是经历PMA刺激和固定破膜操作。
试问:固定破膜对CD19影响这么大?我需要固定破膜后再染色CD19嘛,老师们有这方面经验嘛?

表染CD19-大多数仍是B细胞

表染CD19-大多数仍是B细胞

表染CD19+固定破膜-很少的CD19

表染CD19+固定破膜-很少的CD19

同管2,固定破膜后很少的CD19

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发表于 2021-7-21 17:17:04 | 显示全部楼层
从FSC/SSC的分布看,细胞都碎了。
建议先用样本,在固定破膜步骤上进行好好摸索保证细胞完整的条件,条件摸索熟练了,再做实验样本。
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发表于 2021-7-23 15:07:30 | 显示全部楼层
本帖最后由 stf1990 于 2021-7-23 15:24 编辑

FSC-SSC窗跟我染FOXP3的很像,基本破膜以后就是这样。 你zoombie dye窗口活细胞比例很高,好奇你细胞因子结果如何?
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发表于 2021-7-23 21:27:38 | 显示全部楼层
感觉你这个圈门的顺序很奇怪 先去黏连体再找细胞。。。 你不是应该先改变电压看哪些是目标细胞哪些是细胞碎片吗?圈细胞那个FSH SSC的门上机时可以再调调电压
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