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[凋亡检测] 凋亡检测(BD公司试剂盒FITC-AV/PI)问题咨询

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 楼主| 发表于 2021-7-29 11:37:38 | 显示全部楼层 |阅读模式
4流星
各位大佬们好,在读研究生一枚,最近做凋亡遇到问题,还请指教,感激不尽!

    1、按我们的建模条件建模后用CCK8测细胞活力,多次验证大概64%左右

    2、流式测凋亡,早期凋亡率很低(抱歉暂且无图),大概2.5-5%

    3、操作流程如下:  
                                 A、建模后,用不含EDTA的胰酶1ml消化贴壁细胞37摄氏度,2min,生理盐水终止反应后用1ml的枪吹打,细胞很容易脱落
                                    (一个6cm 皿细胞约10ˆ6个)。
                                  B、收集各组细胞于15ml离心管中,离心沉淀细胞
                                  C、将试剂盒内10✖️binding buffer 配置成1✖️,取250ul重悬
                                  D、每管取100ul(细胞数约5✖️10^ 5),加入AV、PI染液各5ul,室温避光染15min
                                  E、每管补加1✖️binding buffer 200ul后上机

   4、疑问?  A、我们使用临床上用的生理盐水洗细胞和配置binding buffer,会影响ca2+因此影响AV结合吗?
                    B、之前师兄答辩时,专家建议早凋用7AAD试剂盒,请问7AAD比PI染料更好吗?
                    C、我的总体流程,有哪些地方有明显错误吗?

                    感谢各位老师,非常感谢,感激不尽,希望得到您的帮助、建议、指正。


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发表于 2021-7-29 12:10:35 | 显示全部楼层
7-AAD还是PI,不是关键。
关键是缓冲液的稀释,还是建议用PBS配制。
另外,无图无真相,建议还是放图或FCS文件。
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 楼主| 发表于 2021-7-29 16:08:37 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-7-29 12:10
7-AAD还是PI,不是关键。
关键是缓冲液的稀释,还是建议用PBS配制。
另外,无图无真相,建议还是放图或FCS ...

谢谢倪老师的建议,我下次做了后记得补图片
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发表于 2021-7-29 17:02:04 | 显示全部楼层
TRYTRYTRY 发表于 2021-7-29 16:08
谢谢倪老师的建议,我下次做了后记得补图片

1、7-aad和PI应该影响不大。
2、一般凋亡检测要收集培养上清,和消化下来的悬液混合后离心收集细胞,特别对于一些处理组样本,细胞会悬浮于培养上清中,说明书上应该也提到了。如果你的模型组有类似情况,会导致凋亡结果偏低。
3、binding buffer配置如果说明书没有说明,还是咨询一下厂家
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 楼主| 发表于 2021-7-29 19:40:35 | 显示全部楼层
家的感觉 发表于 2021-7-29 17:02
1、7-aad和PI应该影响不大。
2、一般凋亡检测要收集培养上清,和消化下来的悬液混合后离心收集细胞,特别 ...

非常感谢老师,我没有注意收集上清这个问题,我下次做的时候改进
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