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[凋亡检测] 历时1个月,终于做出来早期凋亡,望老师和同道们指点~

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 楼主| 发表于 2021-8-4 00:57:15 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 zxt2009 于 2021-8-4 01:00 编辑

历时1个月,终于做出来贴壁细胞的早期凋亡,望老师和同道们指点,在发图前先感谢老师,尤其是倪老师和tiger两位热心老师,这个网站有你们一直热心无偿回答问题,才能让我这样的流式菜鸡能起步。试剂盒我推荐一下,希望老师们不要给我定性为打广告,用的是翌圣生物的凋亡试剂盒(AV/PI染色)

不过还有个问题,看凋亡结果是只统计右下象限,还是右下+右上呢?这个就很迷惑,有帖子说2个象限相加,但也有说只统计右下,下面是图。


HK-2 凋亡.jpg
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发表于 2021-8-4 07:38:53 | 显示全部楼层
严格来说,只有Q3才算真正的凋亡,Q2部分,由于无法将晚期凋亡和坏死区分开,所以会产生争议。
话说这么说,但现在大多数文章里面,还是把Q2和Q3这两部分加在一起算的。

不过你这次的结果里面,为什么Q1这部分一点信号都没呢?另外,你这个贴壁细胞,处理上是否有技巧分享给其它站友呢?
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 楼主| 发表于 2021-8-5 03:00:23 | 显示全部楼层
本帖最后由 zxt2009 于 2021-8-5 03:09 编辑
niwanmao 发表于 2021-8-4 07:38
严格来说,只有Q3才算真正的凋亡,Q2部分,由于无法将晚期凋亡和坏死区分开,所以会产生争议。
话说这么说 ...

对的,我记得好像倪老师您提到过,Q3才是严格意义上的凋亡群体,Q2因为混入了PI,所以无法区分晚凋与坏死。
Q1的信号不多,可能和我PI染色时间有关,我是AV-FITC染色15分钟,然后再加入PI染色液,染色5分钟,再上机,不像其他人,可能染色时间更长点,也许Q1信号会多点,我的PI单染组还是没问题。另外就是这个公司试剂盒,提供的过去使用者的贴壁细胞图片作为参考,也是Q1象限细胞损失很少。

关于贴壁细胞处理,我之前发过帖子,就是提问到正常组Q3假阳性太多,这个问题困扰了我许久,最后我在赛默飞官网找到了一个技巧:贴壁消化后,用完全培养液再继续37℃重悬培养细胞30分钟,减少因消化带来的PS外翻假阳,我这次尝试后,发现正常组相对理想了很多。还有就是一定要选试剂质量过硬公司的凋亡试剂盒,钱多几百元但是一次成功,实际上反而能节约科研经费,因为培养细胞或者收集细胞也是需要耗材和其他试剂的。

最后还有个问题想问一下倪老师,我是用的无EDTA的胰酶消化细胞,消化时间很长,大约要9分钟(平时带EDTA胰酶只需要2分钟),才能勉强大部分消化下来,我能否用含EDTA胰酶消化,然后再用结合Buffer缓冲液冲洗1-2次,这样消化时间短点,也许能减少Q3的细胞量?我镜下观察,发现在长达9分钟的消化过程中,还是有些细胞顶不住,漂起来了,或者可能从早凋转向了晚凋。
您觉得这样减少消化时间,然后多1-2次离心,可以接受吗?

最后再次感谢您的帮助和耐心指导。

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 楼主| 发表于 2021-8-5 03:28:07 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-8-4 07:38
严格来说,只有Q3才算真正的凋亡,Q2部分,由于无法将晚期凋亡和坏死区分开,所以会产生争议。
话说这么说 ...

再补一个空白和单染的图
空白和单染.jpg
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发表于 2021-8-5 09:15:31 | 显示全部楼层
zxt2009 发表于 2021-8-5 03:00
①对的,我记得好像倪老师您提到过,Q3才是严格意义上的凋亡群体,Q2因为混入了PI,所以无法区分晚凋与坏 ...

Q1少是可以的,但是一点都没有,总觉得怪怪的。

至于贴壁细胞的处理,你分享的赛默飞官网的技巧,理论上是可行的,并且你验证过可行的话,应该是没错了。

至于消化,如果第2条技巧可行的话,是否与酶的种类无关?
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发表于 2021-8-5 17:25:13 | 显示全部楼层
你好,请问你有收集细胞上清吗
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 楼主| 发表于 2021-8-5 21:29:37 | 显示全部楼层
逗逗 发表于 2021-8-5 17:25
你好,请问你有收集细胞上清吗

有收集上清液的细胞。
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 楼主| 发表于 2021-8-5 22:31:44 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-8-5 09:15
Q1少是可以的,但是一点都没有,总觉得怪怪的。

至于贴壁细胞的处理,你分享的赛默飞官网的技巧,理论上 ...

我打算再做一次,这次用带EDTA的做,消化时间短一点,然后温育30min,再用结合缓冲液清洗离心2次,再上样,先做个AV-FITC单染试试,如果可行,就可以考虑用带EDTA的胰酶了
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发表于 2021-8-6 08:47:36 | 显示全部楼层
你好,想请问一下,你说的温育是指消化后,仍然在板内加入全培养基,放入培养箱,再培养30min吗?那收集的细胞上清如何储存呢?
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发表于 2021-9-3 00:18:16 | 显示全部楼层
逗逗 发表于 2021-8-6 08:47
你好,想请问一下,你说的温育是指消化后,仍然在板内加入全培养基,放入培养箱,再培养30min吗?那收集的 ...

继续放到培养皿,放进细胞箱,应该可以吧
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