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[其它] 巨噬细胞BMDM出现两坨不同FSC SSC是因为部分死亡吗

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 楼主| 发表于 2021-8-21 19:59:58 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
本帖最后由 Fzw 于 2021-8-21 20:01 编辑

亲友们,想问一下如下图的出现两个population有可能是其中一团是死掉的细胞吗?是否应该单独选择右边的团块进行后续分析?自己流式经验不够所以还没见过这个样子的FSC-SSC,之前看到的都是左下角有一些聚集的population所以很好排除掉。--------实验背景信息:小鼠骨髓来源分化的巨噬细胞,负载在自己做的材料上用LPS刺激,因为实验特殊需要是带着材料一起用PFA固定,没有洗涤或者活死染色,之后triton-x破膜然后再把细胞从材料上弄下来,染actin跑流式。同批样品没固定的时候做活死染色是有看到不少细胞死掉,所以想知道这里的流式结果是不是其中一个团块是死细胞?还是说需要额外实验确认这一批用的巨噬细胞分化成功与否?


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发表于 2021-8-22 10:31:34 | 显示全部楼层
可以染一个核酸染料(如PI、7-AAD等)或商品化的死活染料(live/dead、Ghost等)。
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 楼主| 发表于 2021-8-23 20:54:35 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-8-22 10:31
可以染一个核酸染料(如PI、7-AAD等)或商品化的死活染料(live/dead、Ghost等)。 ...

好的倪老师,所以仅凭这个FSC-SSC还不能完全判断是否是死细胞是吗?因为之前担心actin在处理过程中(染活死)发生变化,所以之前的想法是立即把细胞和材料一起固定,之后再消化下来跑流式,特意跳过了染活死这个步骤。如果不染会造成这种问题,可能还是得染一下
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发表于 2021-8-24 07:43:59 | 显示全部楼层
Fzw 发表于 2021-8-23 20:54
好的倪老师,所以仅凭这个FSC-SSC还不能完全判断是否是死细胞是吗?因为之前担心actin在处理过程中(染活 ...

如果是事先固定过的,好像是会出现这样分两群的情形,都可以算。
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 楼主| 发表于 2021-8-24 20:57:56 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-8-24 07:43
如果是事先固定过的,好像是会出现这样分两群的情形,都可以算。

老师的意思是两群都可以圈下来作分析吗?造成这种分群的可能性原因是什么?
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发表于 2021-9-2 17:48:30 | 显示全部楼层
不知道楼主有没有在做这个实验之前检测小鼠骨髓来源细胞的纯度,如果纯度没有问题的话,说明这两群细胞应该都是巨噬细胞。另外楼主也说是检测actin,是细胞骨架的组成部分,说明细胞骨架可能发生了变化,而细胞骨架的变化可能会导致细胞形态发生变化,反映在FSC/SSC坐标系中,确实可能会出现两群细胞。建议楼主检查一下死活染色图片,是否确实有两种形态的细胞。或者流式分析两个细胞群在actin表达方面是否有差异(有差异说明可能是细胞骨架变化引起的,没有差异说明可能是其他因素引起的)。
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发表于 2021-9-3 22:09:44 | 显示全部楼层
Fzw 发表于 2021-8-24 20:57
老师的意思是两群都可以圈下来作分析吗?造成这种分群的可能性原因是什么? ...

我们在临床上,凡是出现这样两群FSC大小不一的同类细胞,一般出现在细胞发生凋亡的时候。
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 楼主| 发表于 2021-9-8 11:51:20 | 显示全部楼层
wxd 发表于 2021-9-2 17:48
不知道楼主有没有在做这个实验之前检测小鼠骨髓来源细胞的纯度,如果纯度没有问题的话,说明这两群细胞应该 ...

谢谢你的回复!很有帮助!
- 之前检测过几次骨髓分化细胞的纯度,都比较高,所以在之后的批次没有每次都检测,这次出了问题才开始质疑是否是刚开始的分化失败,不过现在来看可能性较低
- 在流式中两个细胞群的actin差异很明显,同样分群(如下图,633-A为actin,可以看到FSC小的群体整体actin也小一些)。由于材料的关系 死活染色中的细胞轮廓比较模糊,暂时还是不能百分百确定死细胞比活细胞形态上小一些。不过综合倪老师的观点应该很有可能是死细胞了,因为直接PFA固定的关系可能细胞整体比较完整,因此比活细胞群体仅仅小了一些。
你的分析逻辑很有道理!谢谢!
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 楼主| 发表于 2021-9-8 11:53:44 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-9-3 22:09
我们在临床上,凡是出现这样两群FSC大小不一的同类细胞,一般出现在细胞发生凋亡的时候。 ...

好的,谢谢倪老师!
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