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[流式protocol] OMIP 073: 用14色流式方案分析人类胸腺细胞的发育情况

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 楼主| 发表于 2021-8-31 21:57:48 | 显示全部楼层 |阅读模式

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胸腺通过为T细胞的发育提供微环境,在建立功能性适应性免疫系统方面发挥着重要作用。对人类胸腺的发育步骤和细胞群的详细了解可增加我们对免疫缺陷、自身免疫或血液病起源的认识。虽然小鼠的T细胞发育已经有了深入的特征,但对于人类胸腺的发育,特别是发育的早期阶段,仍然缺乏认知。

德国的Sarah-Jolan Bremer等人设计了一个14色流式方案,使胸腺细胞亚群的定义简单而又明确,可对发育不同阶段进行区分并提供参考值。
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作者首先使用live/dead染色和Annexin V染色,来确定活细胞,这样不仅可以排除坏死细胞,而且还可以排除凋亡细胞。由于既往已经观察到胸腺细胞在暴露于糖皮质激素或冷冻等应激性刺激下会发生凋亡,所以用Annexin V染色是有必要的。

CD34+造血干细胞和祖细胞从骨髓迁移到胸腺,在胸腺中经历了特殊的成熟和选择过程。这些早期胸腺祖细胞(ETP)定义为CD34+ CD45RA+ CD1a-,可产生不同的免疫细胞类型。在Notch信号作用下,T细胞特异性基因如CD7被上调,当这些祖细胞表达CD1a时,就成为T系定向祖细胞了,而向其他系如B细胞、NK细胞或DCs的分化则受到了抑制。T细胞受体(TCR)的重新排列发生在CD7+亚群内,在这个阶段,CD4被上调,CD34被下调。因此,不成熟单阳性阶段(ISP4)可分为CD4+ CD34+和CD4+ CD34-人群。此外,作者还发现了一个表达CD4和CD8的早期双阳性(EDP)细胞群,它们仍然表达CD7、中等水平的CD34并显示低水平的CD45表达(EDP CD45low)。这些发现表明,ISP4胸腺细胞在成为双阳性之前不一定完全失去CD34表达或获得高水平的CD45。

祖细胞发育成CD4+ CD8+(双阳性)细胞时,会同时表达功能性TCR β链(与pre-TCR α链配对)。TCR α重排为功能性TCR αβ-CD3复合物铺平了道路,该复合物主要见于双阳性细胞群。双阳性细胞可进一步细分为CD4+ CD8+ CD3-(早期双阳性[EDP])和CD4+ CD8+ CD3+(晚期双阳性[LDP])群体。CD28的表达与TCR β链的表达相关,并提供了不同发育阶段ß选择的信息。TCR γ和TCR δ位点的重排甚至发生在TCR β链重组之前,胸腺细胞从定向祖细胞阶段开始就保持其γδ潜能,并持续很长时间。具有功能重排的TCR γ和TCR δ链的细胞成为CD3+ T γδ细胞。胸腺细胞经历了严格调节的选择过程,以获得广泛但自我耐受的TCR谱系受体。如表达的TCR无法识别自身MHC多肽,则胸腺细胞会死亡,如表达的TCR对自身MHC多肽有过度亲和力,则胸腺细胞被认为存在潜在的自身免疫反应,则将经历阴性选择。只有具有低至中度亲和力的胸腺细胞才被阳性选择。阳性选择的胸腺细胞在选择过程中分化为CD8+细胞毒性T细胞或CD4+辅助性T细胞,这取决于其TCR对MHC I类或MHC II类分子的特异性。具有较高TCR信号强度的细胞可能成为T调节细胞(Treg),其特征是表达CD25和FOXP3。最近的研究结果表明,Treg-commitment在DP阶段就已经发生了。为了离开胸腺环境并迁移到外周,单阳性CD4(SP4)、单阳性CD8(SP8)或Treg细胞需要失去它们的保留标记CD69并上调CD45RA。最后,准备从胸腺输出的T细胞可以通过CD3+ CD45RA+ CD69-表型来识别。
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下图和下表描述了14个亚群的平均百分比。DPs构成最大的亚群,占所有胸腺细胞的四分之三以上,EDPs的数量是LDPs的两倍以上。偏原始(CD45低)的部分由ISP4 CD34+细胞主导,而在更成熟(CD45高)的部分最大的亚群是SP4,其次是SP8、Treg和T γδ细胞。
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最后,大家概览一下胸腺细胞整体的分化过程:
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信源:Bremer SJ, Glau L, Gehbauer C, Boxnick A, Biermann D, Sachweh JS, Tolosa E, Gieras A. OMIP 073: Analysis of human thymocyte development with a 14-color flow cytometry panel. Cytometry A. 2021 Mar 3. doi: 10.1002/cyto.a.24326. Epub ahead of print. PMID: 33655672.

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