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[淋巴细胞相关] 小鼠肿瘤组织CD8+T细胞检测问题

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 楼主| 发表于 2021-9-5 13:24:33 | 显示全部楼层 |阅读模式
3流星
本人流式小白,最近需要检测小鼠成瘤组织浸润淋巴种类及水平。一开始纠结于如何消化肿瘤组织获取单细胞。在浏览各位前辈的帖子中,终于将这个问题克服了,但是又碰到新的问题。最近我打算检测肿瘤中CD8+T细胞水平。获取肿瘤组织单细胞后,分别用PERCP-7AAD,FITC-CD3和APC-CD8a对细胞进行染色,常温染色25分钟,用1%BSA的PBS洗两遍,上机检测。我们的机器是BD FACS calibur。7-AAD阴性细胞约有90%,效果还可以。但是,继续挑选CD3+细胞时就遇到了麻烦,细胞分群不明显。我的圈门过程如图片所示,FCS文件也上传了。恳请各位前辈帮我分析下,FSC和SSC中选取的细胞范围是否合理,CD3的界面中如何画门,我做的淋巴细胞比例是否合理,感谢大家。手动邀请下倪老师,还请倪老师空闲之余帮我分析下!

分析过程

分析过程
FCS文件1.rar (6.69 MB, 下载次数: 2) FCS文件2.rar (4.6 MB, 下载次数: 1) @niwanmao

组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
发表于 2021-9-5 13:53:47 | 显示全部楼层
感觉FSC和SSC那张图你就圈错了,要圈右边的细胞群
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 楼主| 发表于 2021-9-5 14:36:30 | 显示全部楼层
闷油瓶 发表于 2021-9-5 13:53
感觉FSC和SSC那张图你就圈错了,要圈右边的细胞群

老师你好,我这个圈门方法,一方面是查看之前站里一个老师的帖子(14色鼠源肿瘤TILs 染色
https://flowcyto.cn/bbs/thread-6273-1-1.html
(出处: 流式中文网)
),另一个是身边一个同事。他们都是将肿瘤细胞和免疫细胞一块圈起来,没有具体去专门圈免疫细胞。但是我不理解他们的依据是什么,这才想着问问大家
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发表于 2021-9-5 15:55:36 | 显示全部楼层
CART 发表于 2021-9-5 14:36
老师你好,我这个圈门方法,一方面是查看之前站里一个老师的帖子(14色鼠源肿瘤TILs 染色
https://flowcy ...

我的意思是说,散射光图这样圈一下试试
QQ截图20210905155420.png
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发表于 2021-9-5 16:29:50 | 显示全部楼层
7-AAD和FSC/SSC设门圈淋巴细胞的门,请参考我下面这样。

另外,我建议你把这几个标记放在一起做,不要分成三管。
20210905_162850.jpg
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 楼主| 发表于 2021-9-5 19:51:01 | 显示全部楼层
闷油瓶 发表于 2021-9-5 15:55
我的意思是说,散射光图这样圈一下试试

好的,谢谢老师,我试一试
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 楼主| 发表于 2021-9-5 20:57:36 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-9-5 16:29
7-AAD和FSC/SSC设门圈淋巴细胞的门,请参考我下面这样。

另外,我建议你把这几个标记放在一起做,不要分成 ...

感谢倪老师,我照着你的方法,明显分到了一群细胞,十分感谢。
1.分析过程如图所示,A流程是直接两个一起分析,分到了差不多9%双阳细胞;B流程是先分CD3,再找CD8,其中CD3分群不明显,得到了将近6.75%的双阳细胞。想问下倪老师,这两种方法那个更好?
两种方法.jpg
2.在7-AAD通道中,明显可以看到中间还有一群细胞,想问下倪老师,这个算活细胞吗?进一步分析这一群细胞,发现它没有分群。然后分别分析CD3和CD8情况,结果发现CD8基本都是阴性,但意外发现一群CD3强阳性的细胞,不知道这个该怎么解释?
中间一群.jpg
3.最后一个疑问,你说不要分开,放在一起做,指的是单染的样品吗?那我两两组合可以吗?比如AAD和CD3,AAD和CD8,CD8和CD3?不知道我理解的对不对,还请倪老师空闲时间可以解答下我的疑问,感谢倪老师

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 楼主| 发表于 2021-9-5 21:15:17 | 显示全部楼层
闷油瓶 发表于 2021-9-5 15:55
我的意思是说,散射光图这样圈一下试试

老师你好,照着你的方法,我试了一下,大概能分到6.89%的双阳细胞,和倪老师的结果类似,和你分享一下。另外,方法多样,感觉非常纠结,不知道那种方法才是最理想的
未标题-1.jpg

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发表于 2021-9-6 10:15:14 | 显示全部楼层
CART 发表于 2021-9-5 20:57
感谢倪老师,我照着你的方法,明显分到了一群细胞,十分感谢。
1.分析过程如图所示,A流程是直接两个一起 ...

A更准一些,因为可能有些CD3+T在你没圈中的SSC偏大部分。
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 楼主| 发表于 2021-9-6 11:52:56 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-9-6 10:15
A更准一些,因为可能有些CD3+T在你没圈中的SSC偏大部分。

好的,感谢倪老师
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