小鼠肿瘤组织CD8+T细胞检测问题

CART

本人流式小白，最近需要检测小鼠成瘤组织浸润淋巴种类及水平。一开始纠结于如何消化肿瘤组织获取单细胞。在浏览各位前辈的帖子中，终于将这个问题克服了，但是又碰到新的问题。最近我打算检测肿瘤中CD8+T细胞水平。获取肿瘤组织单细胞后，分别用PERCP-7AAD，FITC-CD3和APC-CD8a对细胞进行染色,常温染色25分钟，用1%BSA的PBS洗两遍，上机检测。我们的机器是BD FACS calibur。7-AAD阴性细胞约有90%，效果还可以。但是，继续挑选CD3+细胞时就遇到了麻烦，细胞分群不明显。我的圈门过程如图片所示，FCS文件也上传了。恳请各位前辈帮我分析下，FSC和SSC中选取的细胞范围是否合理，CD3的界面中如何画门，我做的淋巴细胞比例是否合理，感谢大家。手动邀请下倪老师，还请倪老师空闲之余帮我分析下！

分析过程

FCS文件1.rar (6.69 MB, 下载次数: 4)

2021-9-5 13:23 上传

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FCS文件2.rar (4.6 MB, 下载次数: 3)

2021-9-5 13:23 上传

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@niwanmao

闷油瓶

感觉FSC和SSC那张图你就圈错了，要圈右边的细胞群

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闷油瓶 发表于 2021-9-5 13:53
感觉FSC和SSC那张图你就圈错了，要圈右边的细胞群

老师你好，我这个圈门方法，一方面是查看之前站里一个老师的帖子（14色鼠源肿瘤TILs 染色
https://flowcyto.cn/bbs/thread-6273-1-1.html
(出处: 流式中文网)
），另一个是身边一个同事。他们都是将肿瘤细胞和免疫细胞一块圈起来，没有具体去专门圈免疫细胞。但是我不理解他们的依据是什么，这才想着问问大家

闷油瓶

CART 发表于 2021-9-5 14:36
老师你好，我这个圈门方法，一方面是查看之前站里一个老师的帖子（14色鼠源肿瘤TILs 染色
https://flowcy ...

我的意思是说，散射光图这样圈一下试试

niwanmao

7-AAD和FSC/SSC设门圈淋巴细胞的门，请参考我下面这样。

另外，我建议你把这几个标记放在一起做，不要分成三管。

CART

闷油瓶 发表于 2021-9-5 15:55
我的意思是说，散射光图这样圈一下试试

好的，谢谢老师，我试一试

CART

niwanmao 发表于 2021-9-5 16:29
7-AAD和FSC/SSC设门圈淋巴细胞的门，请参考我下面这样。

另外，我建议你把这几个标记放在一起做，不要分成 ...

感谢倪老师，我照着你的方法，明显分到了一群细胞，十分感谢。
1.分析过程如图所示，A流程是直接两个一起分析，分到了差不多9%双阳细胞；B流程是先分CD3，再找CD8，其中CD3分群不明显，得到了将近6.75%的双阳细胞。想问下倪老师，这两种方法那个更好？

2.在7-AAD通道中，明显可以看到中间还有一群细胞，想问下倪老师，这个算活细胞吗？进一步分析这一群细胞，发现它没有分群。然后分别分析CD3和CD8情况，结果发现CD8基本都是阴性，但意外发现一群CD3强阳性的细胞，不知道这个该怎么解释？

3.最后一个疑问，你说不要分开，放在一起做，指的是单染的样品吗？那我两两组合可以吗？比如AAD和CD3，AAD和CD8，CD8和CD3？不知道我理解的对不对，还请倪老师空闲时间可以解答下我的疑问，感谢倪老师

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闷油瓶 发表于 2021-9-5 15:55
我的意思是说，散射光图这样圈一下试试

老师你好，照着你的方法，我试了一下，大概能分到6.89%的双阳细胞，和倪老师的结果类似,和你分享一下。另外，方法多样，感觉非常纠结，不知道那种方法才是最理想的

niwanmao

CART 发表于 2021-9-5 20:57
感谢倪老师，我照着你的方法，明显分到了一群细胞，十分感谢。
1.分析过程如图所示，A流程是直接两个一起 ...

A更准一些，因为可能有些CD3+T在你没圈中的SSC偏大部分。

CART

niwanmao 发表于 2021-9-6 10:15
A更准一些，因为可能有些CD3+T在你没圈中的SSC偏大部分。

好的，感谢倪老师