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[流式protocol] OMIP 074:检测B细胞免疫球蛋白的多样性

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 楼主| 发表于 2021-9-10 11:01:11 | 显示全部楼层 |阅读模式

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「抗体发现研究」在促进治疗性单克隆抗体(mAbs)的分离和表征方面发挥了作用,这些抗体可用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染病,如流感和人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)。人类抗体分离的方法包括B细胞永生化、酵母或噬菌体展示、单个B细胞培养以及抗原特异性单B细胞分选。后两种方法依赖于记忆B细胞的单细胞分选,通常需排除门来去除污染的T细胞(CD3、CD4、CD8)、单核细胞/巨噬细胞(CD14)和死细胞(死活染料),并加入B细胞标志物(CD19+CD20+)和类别转换的记忆B细胞标志物(IgD-IgM-IgG+CD27+)。然而,目前B细胞免疫球蛋白亚类信息,通常是通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对血清或血浆样品进行单独分析来评估。而不是直接对B细胞进行表型分析。因此,Leonard Nettey等人设计并优化了一个多色方案,可在单细胞水平上捕获抗体亚类信息。

方案
2021-09-08_08-10-36.jpg


设门
下图是对人B细胞的IgG和IgA亚类表型的设门策略。
(A) 通过Time图去除不稳定信号、Single cells去除粘连体、圈淋巴,再接着选死活染料阴性的活细胞区域。
2021-09-08_08-13-08.jpg

(B) B细胞可以通过CD19+和/或CD20+的表达圈出来。
(C) B细胞根据CD21和CD27分成四群不同状态的B细胞(AM, activated memory; RM, resting memory; TLM, tissue-like memory) 。
2021-09-08_08-20-38.jpg

(D)类别转换的B细胞可以根据IgD-、IgM-圈出。(E)IgG和IgE的相互排斥表达有助于识别IgE+类型转换的B细胞。(F)由于D图的门,荧光染料之间的Spreading error可能导致门内可能会有一些naive B混入,故进一步通过IgA和IgG,分出IgA+和IgG+类型转换B细胞,从而对其IgA和IgG亚类的分析会更准确。
2021-09-08_08-20-52.jpg


这个方案是不是很简单?



信源:Nettey L, Ballard R, Liechti T, Mason RD. OMIP 074: Phenotypic analysis of IgG and IgA subclasses on human B cells. Cytometry A. 2021 Sep;99(9):880-883. doi: 10.1002/cyto.a.24341. Epub 2021 May 3. PMID: 33939254.

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发表于 2021-9-10 17:14:15 | 显示全部楼层
老师,您好,我看配色中有IG2-Biotin,中文叫生物素,
1. 这是一个荧光吗?检测时用那个通道呢?
2. 我一般认为生物素和二抗有关,老师可以介绍一下吗?
谢谢
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 楼主| 发表于 2021-9-11 08:33:17 | 显示全部楼层
Veblen 发表于 2021-9-10 17:14
老师,您好,我看配色中有IG2-Biotin,中文叫生物素,
1. 这是一个荧光吗?检测时用那个通道呢?
2. 我一般 ...

仔细看那张表,下面的streptavidin-BV750结合的Biotin,就是与生物素标记的IgG2结合,所以最后的荧光就是BV750
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发表于 2021-9-18 17:53:03 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-9-11 08:33
仔细看那张表,下面的streptavidin-BV750结合的Biotin,就是与生物素标记的IgG2结合,所以最后的荧光就是 ...

老师,您好。这样的话,也就是说Biotin 可以与IgG2特异性结合?
然后streptavidin与Biotin结合,然后检测后面的BV750通道就可以了。
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 楼主| 发表于 2021-9-19 08:31:07 | 显示全部楼层
Veblen 发表于 2021-9-18 17:53
老师,您好。这样的话,也就是说Biotin 可以与IgG2特异性结合?
然后streptavidin与Biotin结合,然后检测 ...

不是说IgG2和Biotin特异性结合,而是把IgG2标记上Biotin,标记技术很成熟,你可以把Biotin想象成不发光的「荧光素」。
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发表于 2021-9-21 09:54:37 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-9-19 08:31
不是说IgG2和Biotin特异性结合,而是把IgG2标记上Biotin,标记技术很成熟,你可以把Biotin想象成不发光的 ...

理解了,这样的话,至少我认为IgG2与Biotin是特异性结合的,Biotin不会与其他抗原结合
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