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多色流式细胞术诊断原发性免疫缺陷疾病

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 楼主| 发表于 2021-10-4 16:43:43 | 显示全部楼层 |阅读模式

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多色流式细胞术诊断原发性免疫缺陷疾病
原发性免疫缺陷病 (PIDD) 是一大类影响人类免疫系统的罕见遗传性疾病。 PIDDs主要是单基因缺陷,已有超过300个PIDDs。 PIDD罕见,然而,最近的报告表明 PIDD 比以前认为的还是要更常见一些,估计患病率为2.3/10万人。 PIDD 患者对感染的易感性增加,有时伴有自身免疫性疾病、自身炎症性疾病、过敏性疾病和恶性肿瘤。早期诊断和治疗对于改善 PIDD 患者的预后至关重要,但有时,这些疾病因其临床多样性而被误诊。 PIDD 的诊断目前基于临床检查和免疫学调查,包括全血细胞计数、分类和血清免疫球蛋白水平。
流式细胞术可以区分各种细胞,是评估 PIDD 患者免疫状态的有用工具。随着通过表面蛋白表达模式对免疫细胞进行分类的方法不断发展,细胞可以分得越来越细,在免疫系统疾病中的诊断作用也越来越明显。尽管多色流式细胞术是一种强大的工具,即使在少量样品中也能识别亚群,但不同研究实验室的结果缺乏可比性的原因有很多,包括样品处理、染色和数据分析方法以及设备和试剂。为解决这些问题,多个国际联盟努力标准化流式细胞术方案,并发布了一些抗体组合方案。
在此,我们希望(1) 使用标准化的多色流式细胞术方案检测来描述各种淋巴细胞亚群的参考值,以及 (2) 通过使用该检测结果来识别 PIDD 患者的免疫学特征。

标准化方案
一共7管,各管10色,详见下表:
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设门PBMC 方案的设门策略
淋巴细胞和单核细胞基于FSC和SSC分布图 (A) 进行设门。 CD14/CD16散点图区分三种不同类型的单核细胞 (B)。在淋巴细胞门内,分别通过 CD3 和 CD19 的表达来区分 T 细胞和 B 细胞(C)。 NK 细胞为 CD16+CD56+ 群体 (D)。基于 CD27 表达,分出 CD27-naïve B 细胞和 CD27+ 记忆 B 细胞 (E)。 T 细胞分为 CD4+ Th 细胞和 CD8+ Tc 细胞 (F),这些亚群进一步细分为 CD45RA+ 初始 T 细胞和 CD45RO+ 记忆 T 细胞 (G)。
Fig1.jpg


T1 方案的设门策略
基于 CD3+ T 细胞设门,iNKT 细胞为TCR Vα24/Vβ11 双阳性细胞群 (A)。在 CD3+CD4+ Th 细胞内,CD45RA+CD31+ 细胞是 RTE (B)。 CD4+ 记忆 T 细胞和 CD8+ 记忆 T 细胞均分为两个群体:CCR7+CD62L+ 中央记忆 T 细胞和 CCR7-CD62L-效应记忆 T 细胞 (C-D)。
Fig2.jpg


T2 方案的设门策略
基于 CD3+ T 细胞设门,通过 TCRαβ 与 TCRγδ 图 (A) 分出 αβ T 细胞和 γδ T 细胞。在 αβ T 细胞内,DNT 细胞为 CD4-CD8-群体(B)。基于 CD3+CD4+ Th 细胞设门,可以将 Treg 细胞分出来(CCR4+CD25+CD127low)(C-D)。
Fig3.jpg


T3 方案的设门策略
基于 CD4+ 记忆 T 细胞设门,CCR6 与 CXCR3 散点图能够识别 Th1、Th2 和 Th17 细胞 (A)。 Th17 细胞也可通过 CCR6+CD161+ 分出 (B)。CD4+Th细胞中可进一步分出CD45RO+CXCR5+ TFH 细胞 (C) 和 CD38+HLA-DR+ 活化 T 细胞 (D) 。
Fig4.jpg


B1 方案的设门策略
基于 CD19+ B 细胞设门,CD24 与 CD38散点图可分出过渡 (TrB) (CD24brightCD38bright)、初始 (CD24+CD38dim) 和记忆 (CD24+CD38-) B 细胞和浆母细胞 (PBs) (CD24-CD38bright) )。 TrB 细胞通过 CD10 与 CD21 图 (B) 进一步分为两个群体:CD10+CD21- (Tr1) 和 CD10+CD21+ (Tr2)。 TrB 细胞和 PBs 也通过 CD38 与 IgM散点图 (C) 区分。
Fig5.jpg


B2 方案的设门策略
基于 CD19+CD27+ 记忆 B 细胞设门,转换记忆(Sw+记忆)和 IgM 记忆(IgM+记忆)B 细胞分别为 IgM-IgD- 和 IgM+IgD+ 群体(A)。在转换记忆 B 细胞内,还可评估 IgG (B) 和 IgA (C) 的表达。
Fig6.jpg


DC 方案的设门策略
基于 CD45+ 设门,DC细胞表型为谱系抗体均阴性(CD3-、CD14-、CD16-、CD19-、CD20-和 CD56-)和 HLA-DR 阳性群体 (A)。 CD123 与 CD11c 的关系图能够描绘 pDCs (CD11c-CD123+) 和 mDCs (CD11c+CD123-) (B)。活化 mDC 被描述为 CD11c+ mDC 中的 CD83 阳性群体 (C)。在谱系阴性和 HLA-DR 阴性人群中,可分出嗜碱性粒细胞 (CD123bright) 和嗜酸性粒细胞 (CD123dim) (D)。
Fig7.jpg


0~20岁各类免疫细胞参考值各类PID的免疫细胞缺陷特征
20211004_150702.jpg

原发性免疫缺陷病患者的免疫表型分析。 X 轴和 Y 轴分别显示疾病和淋巴细胞亚群。蓝色表示显著降低,橙色表示显著增高。颜色越深,差异越显著。
20211004_150814.jpg


信源:Takashima T, et al. Multicolor Flow Cytometry for the Diagnosis of Primary Immunodeficiency Diseases. J Clin Immunol. 2017 Jul;37(5):486-495. doi: 10.1007/s10875-017-0405-7. Epub 2017 Jun 8. PMID: 28597144.



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