流式实验重复多次，多大的差异才算是好的？

niwanmao

多好才够好？
任何可重复性工作都会有这样一个问题：多好才够好？

这里面需涉及到三个主要的概念： 准确度（Accuracy），是通过测量获得的量值与被测量的真值之间的一致性。 真实度（Trueness），定义为从大量测试结果中获得的平均值与可接受的参考值之间的一致性。 精密度（Precision），是重复测量的分散程度，评估批内（“重复性”）或批间（实验室间：“再现性”）。精密度由标准偏差和变异系数 (CV) 量化。

以造血干祖细胞绝对计数检测为例，按CD34 ISHAGE指南，无论仪器和试剂制造商如何，应当为CD34选择合适的亮度足够的抗体和适当的设门方案时，保证绝对计数结果可重现性，CV应<10.8%。 (Barnett D, et al. Reduction of intra- and interlaboratory variation in CD34+ stem cell enumeration using stable test material, standard protocols and targeted training. DK34 Task Force of the European Working Group of Clinical Cell Analysis (EWGCCA). Br J Haematol 2000;108:784–792.)

同样，CD4 T 细胞绝对计数的CV应<13.7%。(Barnett D, et al. Absolute CD4+ T-lymphocyte and CD34+ stem cell counts by single-platform flow cytometry: The way forward. Br J Haematol 1999;106:1059–1062.)

在实践工作中，往往发现大多数人对良好规范和指南的遵守很差，因此教育是保证可重复性至关重要的部分。（Whitby L, et al. Quality control of CD4+ T-lymphocyte enumeration: Results from the last 9 years of the United Kingdom National External Quality Assessment Scheme for immune monitoring (1993–2001). Cytometry 2002;50:102–110.）

法国2019的一项研究评估了淋巴细胞亚群计数的真实重复性，发现比例较高的亚群（如T 淋巴细胞）可以实现1% 的 CV，而其他较少的亚群（如NK细胞） CV为4.78%。（Ticchioni M, Brouzes C, Durrieu F, Lambert C. Acceptable “real-life” variability for lymphocyte counts by flow cytometry. Cytometry B Clin Cytom 2019;96B:379–388.）

请注意，实现精确计数不仅需要收集足够数量的事件，还需要使用一组对照进行分析验证。实验室间重现性和分析内重现性之间的差距可能会通过标准化来弥补。 ICSH 和 ICCS 对分析内重复性的共识建议是，理想的目标是 CV 小于 10%，但对于比例较低的细胞群体，20% 是可以接受的。（Wood B, et al. Validation of cell-based fluorescence assays: Practice guidelines from the ICSH and ICCS—part V—assay performance criteria. Cytometry B Clin Cytom 2013;84:315–323.）

如何在项目之间、仪器之间和试剂之间实现重现性？
硬件
常有人认为，流式细胞仪的差异是完全标准化的主要障碍。但是，EuroFlow为3激光流式仪器设计的8 色方案，可以在9个制造商的13台仪器中上实现很好的一致性，Harmonemia小组和 CNTRP小组也得出了类似的结论。因此使用同一方案实现不同仪器类型的解读和计数的重现性是可行的。

但需要注意的是，激发波长和发射滤光片规格的微小差异或其他硬件差异（检测器类型）可能会导致对弱表达的敏感性存在一些差异。 EuroFlow（Canto II、LSR II 和 Cyan ADP）、COG（Canto 和 LSR II 仪器）和 Harmonemia（Canto II 和 Navios 仪器）记录了多仪器实验室间设置的可行性。

样品制备方法
另一个影响结果标准化的因素是样品制备方法。这主要是计数标准化的关键。

1.细胞丢失：在 EuroFlow 进行的测试中，样品制备过程中丢失的细胞可相差两倍，而单个荧光染料的强度仅降低了25%。
2.不同细胞类型离体后的存活时间不同。例如，当样品处理延迟24小时以上，浆母细胞的寿命显著缩短。
3.荧光素对光、固定剂甚至铜元素（Qdot染料）等敏感。因此，样品制备方法必须评估表位丢失、损坏、掩蔽或荧光素破坏引起的靶细胞丢失或荧光信号丢失。

仔细的验证、适当的员工培训和外部质量评估是减少样品制备验证所需的工具。然而，不遵守标准操作规程是 QA 失败的常见原因。

分析特异性
流式细胞术重现性的第一个关键是为特定目标群体选择合适的定义标记（即“分析特异性”）。为此，目前发布了白血病和淋巴瘤免疫表型的国际共识指南 （Wood BL, et al. 2006 Bethesda International Consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia by flow cytometry: Optimal reagents and reporting for the flow cytometric diagnosis of hematopoietic neoplasia. Cytometry B Clin Cytom 2007;72(Suppl 1):S14–S22.），HIPC提出了寻求统一用于流式细胞术监测的免疫细胞定义的提案）Maecker HT, et al. Standardizing immunophenotyping for the human immunology project. Nat Rev Immunol 2012;12:191–200.）。 2010 年起，优化多色免疫荧光方案 (OMIP)，在 Cytometry Part A 中开始逐期介绍，OMIP促进了有关特定细胞亚群及其表面或细胞内蛋白质的最佳检测，并且重要的是向该领域展示了优化实验。（流式中文网每期都进行了翻译，部分实验进行了注释，供大家更好的学习：https://www.flowcyto.cn/bbs/foru ... ion=view&ctid=6）

试剂
标准化程序的另一个关键组成部分是抗体。

产生错误结果的原因有多种：

1.抗体克隆无法识别其预期靶标或同时与其他靶标结合，而根源可能是抗体结合能力差，也可能是在某些条件下表面蛋白的脱落/再循环或表位掩蔽，或者一些表位在冷冻保存后会减少或丢失（如CD62），亦或者，细胞固定会降低特定抗体克隆结合靶标的能力，导致测量的信号强度发生变化。
2.不同荧光染料强度不同，是造成差异的另一个可能来源。如果一个弱表达的标记，用了弱的荧光素抗体检测，可能会影响对最终结果的分析和判断。
3.抗体批间差异。染色强度重现性的先决条件是生产的抗体不同批次之间没有显著差异。不幸的是，到目前为止，还没有看到制造商对该参数的严格程度的数据。最近，Böttcher 等人对 157 种不同单克隆抗体的 1323 个连续批次进行了初步研究，他发现虽然总体上CV非常低（中值 CV 为 3.8%），但 还是有8.8% 的抗体CV值超过了 20%（包括 3.6%的批间强度CV超过 30%）。当应用 20% 的严格标准时，不同的荧光染料具有不同的失败率（0% 到 37.5%），用抗体捕获微球比对分析旧批次与新批次，也无法解决稳定性问题，并且无法测试与表位的结合。不过话说回来，该研究表明，抗体试剂的可重复性非常高（91.2% 的抗体CV小于 20%），因此不应成为变异的主要来源。（Böttcher S, et al. Lot-to-lot stability of antibody reagents for flow cytometry. J Immunol Methods 2017.）
4.移液的精度和抗体保存稳定性会影响染色模式和强度。

数据分析
数据分析在任何流式细胞术研究的可重复性中起着重要作用。任何流式细胞术研究都应发表对设门策略的完整解释，参见“关于流式细胞术实验的最低信息”（MIFlowCyt），这是所有流式专业期刊发表文章所必需的，详见流式中文网相关资料：翻译:MIFlowCyt-流式细胞术实验最低信息标准 https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4203-1-1.html (出处: 流式中文网)

使用软件工具进行自动分析可以使设门更加客观，从而提高设门和计数的可重复性。

信源：Kalina, T. (2020), Reproducibility of Flow Cytometry Through Standardization: Opportunities and Challenges. Cytometry, 97: 137-147. https://doi.org/10.1002/cyto.a.23901

云雅味

倪老师，我在做CD3方法学验证的时候设计双染管复孔时遇到个问题。问题描述：设置双染管复孔两个是否科学和设置三个的必要性？能否有相关的资料、法规或标准可以支持两个复孔也是科学的？

niwanmao

云雅味 发表于 2021-10-26 21:49
倪老师，我在做CD3方法学验证的时候设计双染管复孔时遇到个问题。问题描述：设置双染管复孔两个是否科学和 ...

双染是哪两个双染？
一般至少重复三次。

云雅味

niwanmao 发表于 2021-10-26 22:06
双染是哪两个双染？
一般至少重复三次。

CD45、CD3。原来第三方设计的时候只设计了两个复孔，一个空白，两个双染，给到的解释是两个复孔基本能排除系统误差，如果两个孔CV差异太大，基本上是样品差异。我们做专属性、精密度、线性这些做三个双染的复孔比较合理是吧？

niwanmao

云雅味 发表于 2021-10-26 22:13
CD45、CD3。原来第三方设计的时候只设计了两个复孔，一个空白，两个双染，给到的解释是两个复孔基本能排 ...

是的，统计学上，同一个样本重复三次取平均值比较科学。

Yuck

云雅味 发表于 2021-10-26 21:49
倪老师，我在做CD3方法学验证的时候设计双染管复孔时遇到个问题。问题描述：设置双染管复孔两个是否科学和 ...

方法验证重复性不是最少6次吗？

jiangmeng

倪老师，你好。跑同样的抗体颜色， 请问每次都需要调电压和调补偿吗（设置单染管和unstain）？

niwanmao

jiangmeng 发表于 2021-11-9 16:51
倪老师，你好。跑同样的抗体颜色， 请问每次都需要调电压和调补偿吗（设置单染管和unstain）？ ...

同一批次，最好设一组，避免仪器和条件不稳定引起的波动。

云木香

niwanmao 发表于 2021-10-26 22:06
双染是哪两个双染？
一般至少重复三次。

倪老师您好，请问是一个已经装载完成的样本上三次流式？还是一个原始样品，分别做3个装在探针的，各上一次流式？

niwanmao

云木香 发表于 2021-11-20 20:01
倪老师您好，请问是一个已经装载完成的样本上三次流式？还是一个原始样品，分别做3个装在探针的，各上一 ...

后者。