关于小鼠肝脏心脏流式样品处理

0忧郁的王子0

您好，最近跑了一次流式，处理成年小鼠的心脏和肝脏，分析细胞周期（倍性分析），大概流程是这样：
1. PBS洗净，留200ul PBS在6cm皿中用眼科剪剪碎，加入15ml管中；
2. 15ml管中加入0.2mg/ml胶原酶IV，DMEM 10ml，37℃ 100rpm水平摇床（管插入37℃水中），摇1h；
3. 800rpm离心5min，去上清，PBS洗一次，离心去上清，加入0.05%胰酶2ml消化1min，再加2ml DMEM+10%FBS终止，离心后去上清；
4. 2ml PBS洗一次，800rpm离心5min，去上清；
5. 2ml ACK洗1次，800rpm离心5min，去上清；
6. 2ml PBS洗一次，过滤网，收集在1.5ml管；
7. 小离心机4℃ 400g（2200rpm）离心5min，留50ul，吹散后缓缓滴入500ul冰75%乙醇，4℃旋转过夜；
8. 400g 4℃离心5min，去上清，1ml PBS洗一次，去上清，留50ul，加Rnase和PI染色（试剂盒），跑流式。

发现利用FSC-A，SSC-A过滤后细胞都在左下角，可能是凋亡细胞；

                               
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接着用SSC-H，SSC-A去黏连，发现找不到黏连细胞：

                               
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最后分析发现可能都是凋亡细胞。

                               
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大约总细胞量跑了5万个，请问问题是出在处理样品的哪一步骤呀？

niwanmao

1、首先在《最完整的实体组织酶消化指导手册》https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html 中找到最佳的消化酶配方。
2、消化要注意时间，但是这里的1分钟，可以说是肯定没消化下细胞。
3、第7步的4度旋转过夜，对细胞是个伤害，没必要。
4、最后的染色15分钟以上。

0忧郁的王子0

niwanmao 发表于 2021-10-29 20:00
1、首先在《最完整的实体组织酶消化指导手册》https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html 中找到最 ...

多谢老师！