小白报道，人外周血裂解后，图里左下一大团是红细胞碎...

huming

小白一枚，想做单核细胞亚群分析，用自配的裂红液，为什么看到的细胞群和书上常看到的那种散点图分布不一样呢，左下那一大群细胞是红细胞碎片吗，还是淋巴细胞啊......

niwanmao

huming 发表于 2021-11-18 07:41
老师，我还想请教，裂红的环境条件有什么要求吗，温度、是否避光、离心的转数或时间，裂红时室温避光10min ...

裂解红细胞的温度是室温，如果有抗体孵育过，需避光；离心一般500g，5分钟。
如果你用2ml裂解不干净，通常说明你的配制上或原材料上有问题。

niwanmao

1、红细胞裂解后，离心之后是否有红色沉淀？
2、FSC和SSC为何用LOG？

PS：发帖求助，请发在提问版块，不要发在分享版块，此次先帮你转移过去，下不为例，谢谢配合。

huming

niwanmao 发表于 2021-11-15 21:49
1、红细胞裂解后，离心之后是否有红色沉淀？
2、FSC和SSC为何用LOG？

1、离心之后有红色沉淀，后来用pbs又洗了两次，上样的时候没有了。
2、非正版商用软件，参数轴里没有单独的FSC或SSC选项，但是点轴旁边的T，可以选择为线性轴或数坐标，不知道您是不是说这个

谢谢倪老师！

niwanmao

huming 发表于 2021-11-16 00:19
1、离心之后有红色沉淀，后来用pbs又洗了两次，上样的时候没有了。
2、非正版商用软件，参数轴里没有单独 ...

1、离心后有红色沉淀，说明未裂解完全，如确定裂解液配制无问题，应该是裂解液加的太少。我们一般是50ul样本+2~3ml裂解液，室温10分钟。如果担心裂解不干净，可加到5ml。
2、FSC和SSC建议用线性显示，才能看到经典图形。

huming

niwanmao 发表于 2021-11-16 07:29
1、离心后有红色沉淀，说明未裂解完全，如确定裂解液配制无问题，应该是裂解液加的太少。我们一般是50ul ...

裂解液是按照咱们论坛您推荐的那个经典配方配的， pH值在7.2左右，我是100μL的人外周血先加了荧光抗体孵育，然后加2mL的裂解液，这么看应该是裂解液加的少。二次裂红和首次多加裂解液有什么区别吗，二次裂红是用PBS洗了一次之后，向细胞沉淀加了2mL的裂红液，感觉大多数管还是会有红色沉淀，少数管看不到红色沉淀了

huming

老师，我还想请教，裂红的环境条件有什么要求吗，温度、是否避光、离心的转数或时间，裂红时室温避光10min，然后350g离心5分钟，PBS洗涤，500g离心3分钟，这样的步骤和条件有什么问题吗

huming

niwanmao 发表于 2021-11-18 20:01
裂解红细胞的温度是室温，如果有抗体孵育过，需避光；离心一般500g，5分钟。
如果你用2ml裂解不干净，通 ...

今天加了4mL裂解液，感觉红色沉淀明显比之前少了，第一次裂红之后感觉倒上清液倒的不干净，有一些液体残留，这个您通常是怎么操作的呢，在吸水纸上倒扣可以吗，或者是甩一甩可以吗

niwanmao

huming 发表于 2021-11-18 23:01
今天加了4mL裂解液，感觉红色沉淀明显比之前少了，第一次裂红之后感觉倒上清液倒的不干净，有一些液体残 ...

倒完在吸水纸上碰一下，把管口吸干即可，少量残留液体是正常的。但是如果4ml仍有红色沉淀，说明你的原材料或配制肯定有问题。