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[凋亡检测] 血细胞加抗凝剂,再用Annexin V-PI检测凋亡

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 楼主| 发表于 2021-11-17 09:23:12 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星

因为我做的样品是无脊椎的血淋巴细胞,血细胞本身十分容易凝集,所以在Annexin V-PI检测凋亡时操作步骤是1. 先加入了10% ACD抗凝剂,再用PBS重悬,300g 离心10min,PBS 清洗三遍


2. 接下去就是按照碧云天Annexin V-PI试剂盒操作

不知道加了抗凝剂有没有影响,因为抗凝剂就是去结合钙离子的?但是不加抗凝剂又没办法做,所有都是细胞团块。有没有更好的抗凝剂推荐?

而且我发现,加了抗凝剂之后,PBS重悬清洗清洗次数越多,尽管会损失大量细胞,但是细胞越容易分散为单细胞。

实在是做不下去了。

还有就是,从动物体上刚取下来的结缔组织,有没有好的方法能够分散到单细胞。我是用研磨棒轻轻研磨几下,然后用300目过滤,这样会得到的细胞多,但是碎片也很多。       胰酶试过了,几乎没效果,因为是组织块,都长死了。

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发表于 2021-11-17 09:58:30 | 显示全部楼层
抗凝剂你不是已经洗掉了吗?

至于组织的单细胞制备,可参考我们之前的帖子:
最完整的实体组织酶消化指导手册
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5834-1-1.html
(出处: 流式中文网)


可以酶消化结合研磨,研磨可用一下我们的魔滤,比研磨棒损伤小 https://kdt.im/PhQvsr
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 楼主| 发表于 2021-11-20 19:25:54 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-11-17 09:58
抗凝剂你不是已经洗掉了吗?

至于组织的单细胞制备,可参考我们之前的帖子:

好的,谢谢老师。
因为我做细胞凋亡和细胞ROS,如果研磨组织后再加入酶消化,会不会导致凋亡增加和ROS淬灭。而且我做的实验两次取样之间时间间隔较短,时间比较紧。
如果仅用研磨,300目过滤以后,保证去除大部分粘连细胞,在后面的流式细胞仪上再圈出单细胞,是不是可以省略酶消化这一步?
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发表于 2021-11-21 08:51:36 | 显示全部楼层
云木香 发表于 2021-11-20 19:25
好的,谢谢老师。
因为我做细胞凋亡和细胞ROS,如果研磨组织后再加入酶消化,会不会导致凋亡增加和ROS淬 ...

结缔组织不用胶原酶,光靠磨获得细胞十分困难。
酶是否会导致凋亡增加和ROS淬灭,我个人觉得看酶的组合和消化时间。
至于你所说的操作时间间隔较短、时间紧,这个都是可以通过实验合理安排做好的。
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 楼主| 发表于 2021-11-21 10:10:16 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2021-11-21 08:51
结缔组织不用胶原酶,光靠磨获得细胞十分困难。
酶是否会导致凋亡增加和ROS淬灭,我个人觉得看酶的组合和 ...

好的。谢谢倪老师,我再去试试
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