想请教一下关于贴壁细胞凋亡流式的问题，万分感谢！

smmthlun678

各位大佬好，最近做实验遇到了一个问题，我现在在做的实验中需要对软骨细胞进行凋亡的检测，用的是Annexin v/pi的方法，现在出现了一个问题，我在做流式之前都会对搜集的细胞进行一个台盼蓝染色计数，我发现台盼蓝计数的细胞活率都超过了95，但是上机后PI阳性的比例非常高，达到16-17%，这跟我台盼蓝计数结果产生了矛盾，而且这个PI阳性贯穿了所有的组，无论是阴性对照、单染还是双染，甚至有一次我拿了完全没做过实验的软骨细胞，PI阳性也是这么高，有大佬知道这是怎么一回事吗？希望有大佬能看到并解答疑问，万分感谢！

                               
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liuruiluna

smmthlun678 发表于 2021-11-27 20:23
PI染色是在4℃下染了30min

作为死活染料，PI 不能染那么久的，  混悬好了 静置5-10分钟，不洗

smmthlun678

补一个图，刚才图没发出来

liuruiluna

PI 染了多久呢

niwanmao

smmthlun678 发表于 2021-11-26 10:45
补一个图，刚才图没发出来

你的操作步骤、试剂盒来源，能否分别解释一下？

Yuck

染过了？

smmthlun678

liuruiluna 发表于 2021-11-26 18:46
PI 染了多久呢

PI染色是在4℃下染了30min

smmthlun678

niwanmao 发表于 2021-11-26 20:37
你的操作步骤、试剂盒来源，能否分别解释一下？

步骤如下：
1、消化：吸取上清培养基到离心管，然后加入0.25X含EDTA的胰酶250ul/孔（12孔板），消化2min后用生理盐水终止消化，然后把细胞吹打下来加入离心管，1200r/min，离心沉淀10min
2、计数：弃上清液，然后用1ml生理盐水重悬，取10ul悬液用台盼蓝计数
3、流式：再次1200r/min离心洗涤5min，最后制作成200ul的悬液，分四组（对照，av单染，pi单染，双染），每组50ul，分别加入抗体（抗体每种加2ul），孵育30min后加入多聚甲醛，上机。
试剂盒是biolegend的，由于是借用别人的实验室的，多以具体包装我找不到了，给我试剂的人说是没有过期。

smmthlun678

Yuck 发表于 2021-11-27 13:33
染过了？

不确定，我下次试试减少孵育时间

liuruiluna

smmthlun678 发表于 2021-11-27 20:39
步骤如下：
1、消化：吸取上清培养基到离心管，然后加入0.25X含EDTA的胰酶250ul/孔（12孔板），消化2min ...

1）做凋亡，不能用含有EDTA的胰酶
2）不做固定，不要把凋亡和流式抗体染色等同