免疫小白求教：T细胞与肿瘤细胞共培养的问题

xeeloij

请教大家，我想实现的是肿瘤细胞与T细胞共培养的实验，有几个细节请教大家：
1. 我若想知道T细胞的增殖是否被限制了，CFSE是在研磨脾脏后直接标记，然后CD3, CD8, IL-2刺激扩增3d，再与肿瘤细胞共培养？ or 研磨脾脏后，然后CD3, CD8, IL-2刺激扩增3d，然后在加到肿瘤细胞上清前标记CFSE呢？
2. 共培养之后尝试抽提上清中T细胞的RNA，发现根本提不出来（我知道可以用流式，就是探索），不知大家遇到过这个问题否。
3. 肿瘤细胞与T细胞共培养的最佳比例如何确定呢？查阅相关文献，无统一定论呢。
以上，感谢大家答疑解惑～免疫小白求教

niwanmao

1、先染CFSE，再刺激扩增。
2、这属于游离RNA了，是否提取的时间点偏晚？游离RNA非常容易降解。
3、共培养的比例，大多数情况下都是根据肿瘤种类做梯度。

xeeloij

太感谢老师的回复！关注公号良久，受益匪浅，特意从公号过来提问
1. CFSE染上之后，刺激扩增不会导致其荧光减弱吗？我是处于这个考虑
2. 我考虑到了这个，我所收集的是上清中免疫细胞，我做过镜下台盼蓝染色，活着的免疫细胞不少；加之我离心后肉眼可见的沉淀，但仍旧提不出来；
提取时间：共培养后24h，即从脾脏中取出到收集RNA，不超过4d；